羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定和间接ELISA检测方法的建立及应用

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shylockbc
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,C.p)是一种可引发山羊、绵羊、牛和骆驼等多种动物感染并出现淋巴结和内脏器官肿大、局部干酪样坏死等病理变化的重要病原菌,绵羊、山羊感染后引发的疾病通常被称为羊干酪性淋巴结炎(caseous lymphadenitis,CLA)。除上述病理变化外,CLA作为一种渐进性和消耗性的慢性传染病,还可导致患病羊生产性能下降以及繁殖障碍,已经造成巨大经济损失并严重制约养羊业的发展。由于其病程缓慢和致死率低等特点,在临床生产上常容易忽视其发病感染而造成更大损失。目前为止在我国奶山羊的主要养殖区域都有该病原感染发病的相关报道,但目前国内尚无防控该病的疫苗且抗生素的治疗效果不甚理想,因此针对该病原建立一种有效、准确的检测方法也许能够为后续隔离、淘汰、净化等处理措施提供参考依据。本研究从陕西关中部分地区采集大量疑似羊干酪性淋巴结炎病变的脓肿样品,利用细菌分离纯化培养、生化特性试验和16S rRNA PCR测序等方法对分离菌进行鉴定并进行动物致病性试验,同时检测分离菌株的最小抑菌浓度,参照EUCAST 2017欧盟药物敏感性试验标准进行结果判定;选择伪结核棒状杆菌的主要毒力因子磷脂酶D(PLD)作为候选基因,通过构建pET-28a-sumo-PLD重组质粒对其进行原核表达及蛋白溶解纯化,利用灰度分析软件Image-Pro Plus对蛋白浓度进行测定并通过Western blot对其进行验证,表明重组PLD融合蛋白可与其阳性血清发生特异性反应;用已经表达纯化好的PLD融合蛋白作为包被抗原,通过对最佳抗原包被浓度和血清稀释比例的筛选、封闭液的选择、兔抗羊酶标二抗稀释比的优化以及阳性临界值的确定,建立了间接ELISA检测方法,同时通过试验对其敏感性、特异性以及重复性进行了评估,并应用该方法对来源于陕西耀州、陇县、富平的186份羊血清样品进行血清学调查。试验结果如下:1.分离菌株在37℃恒温箱培养48 h后,在营养琼脂上生长稀疏、贫瘠,血琼脂生长良好并形成大小约为1 mm2 mm,白色或淡黄色干燥易推动的菌落;革兰氏染色阳性、菌体形态呈小球状。结合菌落形态以及生化试验和16S rRNA PCR测序鉴定结果,确定为伪结核棒状杆菌,且可感染小鼠引起干酪样脓肿病变。对分离的32株伪结核棒状杆菌进行最小抑菌浓度检测,结果表明,分离菌株对于青霉素耐药率为21.9%(7/23),对庆大霉素耐药率为12.5%(4/32),对克林霉素和利奈唑胺均敏感。2.利用构建好的pET-28a-sumo-PLD重组质粒对磷脂酶D(PLD)进行融合表达,结果表明其主要存在形式为包涵体,纯化后浓度为2.63mg/ml,Western blot试验结果表明表达的PLD融合蛋白可与其阳性血清发生特异性反应。3.将表达纯化的PLD融合蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,试验结果表明最佳抗原包被浓度为1.64μg/mL,最佳血清稀释比为1:200,酶标二抗稀释比为1:5000,通过对48份健康新生羔羊脐带血进行检测确定阳性临界值为0.368。当阳性血清稀释比为1:1600时,OD450检测值仍高于阳性临界值;同时与羊口疮、羊乳房炎和羊溶血曼氏杆菌阳性血清无交叉反应,批内重复试验的变异系数范围在3%10.5%之间,批间重复变异系数范围为5%15%,说明了该间接ELISA检测方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。4.利用所建立的间接ELISA检测方法对陕西关中地区186份奶山羊血清进行检测,其中阳性样品42份,整体阳性率为22.6%(42/186)。结合以上试验结果表明,成功地分离到了32株伪结核棒状杆菌;所分离的伪结核棒状杆菌菌株对多种抗生素敏感,整体耐药情况不严重;用表达得到的伪结核棒状杆菌磷脂酶D融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA诊断方法,具有特异性强、准确率高、重复性优良等特点,能够用于羊群伪结核棒状杆菌的血清学诊断。
其他文献
微生物菌肥是一种含特定有益微生物的活体肥料,在功能菌群的生命活动作用下,增加对植物的养分供给、促进植物生长,其研发和推广对减少化肥施用、改善生态环境也有重要意义。但微生物菌肥目前仍未在我国的花卉苗木产业中得到广泛推广应用,关键原因是未能筛选出针对花卉苗木的特定功能菌。丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)是自然界中分布最广、功能最重要的土壤共生微生物,能够
目的:医疗卫生费用的不断上涨,给人们带来了极大的经济负担。加强对医疗费用的研究,对影响其上涨的主要因素进行探索,是有效制定合理控制医疗费用的途径。然而不同医保支付方式下的住院费用也大不相同,有必要对我国不同地区不同医保支付方式之间费用的差异进行比较。通过对我国三级医院剖宫产住院患者医疗费用进行分析,掌握住院费用构成情况,并运用方差分析和逐步多元回归分析,对患者住院费用的主要影响因素进行分析,寻找影
近年来,我国经济快速发展,国内城市化水平不断提高,在之前几十年的发展历程中,为能更好适应国内经济发展速度及人民对高水平生活的要求,我国地表建筑呈现了从单层、双层、多层、高层、超高层的发展态势。城市道路也由双向两车道向四车道、六车道发展,地面道路向立交桥道路、高架桥道路等方向发展,但与此同时城市问题也更加凸显,城市中交通运输压力变大,地面空间可用率下降,人均绿化率减少,有效开发与利用地下空间是解决上
科学技术的不断创新促进了制造业产业结构升级,国家的现代化建设对机械零件与加工工艺提出更高的要求。因此,迫切需要性能优良的材料与精密高效的加工技术来满足机械加工制造
伴随着互联网的飞速发展,信息资源指数式的增加在给人们的生活带来便利的同时,也给人们在信息选择方面带来了很大的困扰。如何为每个用户提供及时、准确、并且满足个性化需求
真实人物的快速仿真技术在虚拟游戏、三维电影制作,军事虚拟演练和虚拟社区等方面具有重要的研究价值和商业价值。本文对人物模型的快速骨架提取以及蒙皮算法进行了研究。传统拉普拉斯收缩法和L1测度方法存在骨架收缩不均匀以及对球状模型效果不佳的问题,LBS算法具有皮肤无法有效得到支撑而塌陷的副作用,DQS算法存在关节膨胀的缺陷,本文针对以上缺陷进行了改进,改进如下:本文采用点云收缩和骨架提取同步进行的方式进行
微表情传递着非常重要的潜在信息。但是由于其持续时间短并且动作幅度非常小,使它很难被人眼所捕捉。因此,开发一种自动检测微表情的系统是非常必要和重要的。该项目使用了机
梁的抗剪破坏通常属于脆性破坏,其危害程度远大于其抗弯破坏,因此克服抗剪破坏一直是混凝土领域中的重要课题。ECC(Engineered Cementitious Composites,ECC)是一种具有超高韧性和良好裂缝控制能力的纤维增强水泥基复合材料。混凝土-ECC梁是一种以ECC替换钢筋混凝土(RC)梁受拉区部分混凝土、使用高强钢筋的新型的钢筋混凝土组合构件。与RC梁相比,ECC可以改善RC梁受
抗缪勒氏管激素(Anti-Müllerian Hormone;AMH)又称缪勒氏管抑制物,是胚胎发育阶段控制性腺分化的重要激素之一。主要负责雄性动物早期胚胎输卵管性腺前体的退化,以及雌性家禽早期胚胎右侧输卵管的退化。但是AMH在胚胎发育早期阶段对性腺分化和输卵管前体退化的分子学机制依然尚未明确。近年来基因组精确编辑技术的突破性进展为AMH功能研究提供了良好的技术支持。尤其是CRISPR/Cas9的
至今,关于生物分子马达定向输运的研究已引起学者们的广泛兴趣。分子马达是存在于生物体内能够把化学能转化为机械能的一大类酶蛋白生物分子,主要参与细胞内的货物输运过程、