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为了探索建立有效、价廉而易操作的猪卵母细胞玻璃化冷冻方案,本研究以猪体外成熟MII期卵母细胞为试验材料,着重从冷冻保护剂、冷冻载体、玻璃化冷冻前预处理(化学去脂)等环节出发,开展了如下四个方面的试验。
(1)试验一研究了化学去脂(chemicaldelipation)对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻的影响。结果显示:①存活率:化学去脂组和直接冷冻组、离心冷冻组差异不显著(P>0.05)②卵裂率:化学去脂组和直接冷冻组、离心冷冻组差异显著(P<0.05),离心冷冻组和直接冷冻组差异不显著(P>0.05)③囊胚率:化学去脂组和直接冷冻组差异显著(P<0.05),化学去脂组和直接冷冻组差异不显著(P>0.05)。结果说明:化学去脂后有助于提高猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻效果。
(2)试验二比较了开放式拉长细管法(Open pulled straws,OPS)与冷冻帽(Cryotop)、自制载体Cryotip用于猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻的效果。结果显示:我们自行研制的冷冻片(Cryotip)与OPS(对照组1)、Cryotop(对照组2)之间在存活率、卵裂率和囊胚率各组之间差异均不显著(P>0.05),说明自制载体具有和成品载体一样的冷冻效果,可以取代昂贵的商业化载体用于卵母细胞玻璃化冷冻。
(3)研究了ES1+VS1、ES2+VS2、ES2+VS3、ES2+VS4四种冷冻保护剂的组合对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻发育效果的影响。结果显示:①存活率、卵裂率:ES1+VS1、ES2+VS2、ES2+VS3、ES2+VS4各组差异均不显著(P>0.05)②ES2+VS2、ES2+VS3与ES1+VS1(对照组)囊胚率上差异显著(P<0.05),结果说明用不含有DMSO的冷冻保护剂冷冻猪MII期卵母细胞也是可行的。
(4)分别运用含不同糖份的冷冻复苏液实施玻璃化冷冻复苏,研究含不同糖份的冷冻保护剂对猪MH期卵母细胞玻璃化冷冻发育效果的影响。结果显示:①海藻糖、聚蔗糖(ficoll400)与蔗糖(对照组)在存活率、卵裂率和囊胚率各组之间差异均不显著(P>0.05)②在海藻糖和蔗糖的冷冻保护剂中的试验中均得到了囊胚,而在聚蔗糖中没有得到囊胚。试验表明:运用海藻糖玻璃化冷冻猪MII期卵母细胞是可行的。
综上所述,本研究中选用Cryotop作玻璃化冷冻载体,使用EG+DMSO+蔗糖或者海藻糖冷冻保护剂,并在猪的MII期卵母细胞玻璃化冷冻之前对其实施预处理(化学去脂),成功建立了猪的MII卵母细胞有效、经济、稳定的玻璃化冷冻复苏及体外培养技术体系。