论文部分内容阅读
特发性基底节钙化（Idiopathic basal ganglia calcification，IBGC，OMIM213600）是一种以大脑基底节或/及其他部位发生异位钙化为特征的神经系统遗传疾病，患者在临床上可表现出帕金森症状、不自主运动、头痛、记忆力下降、精神异常和癫痫等，其遗传方式有常染色体显性和常染色体隐性两种，具有遗传异质性。该病在1850年由Bamberger首次报道，至今160多年来不清楚其致病原因，直到2012年本研究鉴定出其第一个致病基因 SLC20A2，才揭开IBGC的致病面纱。随后世界不同课题组相继又鉴定出3个IBGC致病基因：PDGFRB、PDGFB和ISG15。本研究对IBGC第一个致病基因的精细定位、鉴定、功能及基因型与表型关系进行分析。 本研究收集并鉴定了一个来自中国山东常染色体显性遗传的IBGC大家系（SD-IBGC），对该家系进行微卫星连锁分析，发现其致病基因与本课题组之前报道的来自河南IBGC家系（HN-IBGC）致病位点8p21.1–8q11.23连锁，其中在微卫星标记D8S524，D8S531，D8S532，D8S587和D8S1831产生的LOD值均大于3。进一步对SD-IBGC家系进行精细定位，将致病区间缩短在微卫星标记D8S505和D8S1833之间，该区间长约18.7Mb，包含77个候选基因。根据基因的表达部位和功能，选择41个基因进行桑格测序，发现 HN-IBGC家系先证者携带SLC20A2突变c.1492G>A/p.Gly498Arg，RFLP实验证实该突变在家系内与疾病共分离。同时在 SD-IBGC家系先证者中鉴定出两个 SLC20A2突变：c.1802C>G/p.Ser601Trp和c.362C>G/p.Ser121Cys，进一步分析发现 c.1802C>G/p.Ser601Trp来自父亲，c.362C>G/p.Ser121Cys则来自母亲；c.1802C>G/p.Ser601Trp引发的脑钙化较为严重，而 c.362C>G/p.Ser121Cys造成的基底节钙化很轻；同时携带两个突变的先证者及其妹妹则有严重的颅内钙化现象，临床表现为难治性癫痫、智力障碍等，生活不能自理。RFLP实验证实这两个突变在先证者父亲和母亲家系内分别与脑钙化的疾病表型共分离。进一步对来自北京、巴西和西班牙的 IBGC患者进行SLC20A2基因突变检测，又鉴定出5个SLC202A新突变：c.1802C>T/p.Ser601Leu，c.1409delC/p.Pro470Leufs*38，c.1723G>A/p.Glu575Lys，c.1784C>T/p.Thr595Met和c.124_126delGTG/p.Val42del。针对上述8个突变在508例正常汉族人群和192例高加索人群中进行了验证，均未发现这些突变，在千人基因组计划数据库中也未发现这些改变。这些数据从遗传上证实SLC20A2很可能为IBGC致病基因。随后，通过与华中科技大学同济医学院附属协和医院、同济医院、武汉大学人民医院以及中山大学第一附属医院合作，我们又进一步收集并鉴定了10个IBGC家系和18个散发患者。对该患者群体进行 SLC20A2基因测序又鉴定出5个 SLC20A2新突变：c.430+1G>A，c.431-2A>T，c.1492G>C/p.Gly498Arg，c.1581_1582delGC/p.Gln528 Argfs*70和c.1640G>C/p.Gly547Ala。对两个剪接突变c.430+1G>A和c.431-2A>T进行体外剪接实验验证，发现这两个突变均可造成异常剪接：c.430+1G>A突变可造成在第3个内含子距原始供体位点51bp处以及第3外显子内距原始供体位点30bp处进行错误剪接，产生异常转录本，导致移码产生提前终止（p.Val144Glyfs*17）和缺失第134到143位氨基酸（p.(Gly134_Ile143del)）；而c.430-2A>T突变则可造成在第4个外显子内距受体位点16bp处和67bp处进行剪切，两个转录本均可导致移码产生提前终止（p.Val144Aspfs*22和p.Val144Glufs*5）。SLC20A2基因编码III型钠磷转运体2（PiT2），在体内广泛表达。为了从功能上解释SLC20A2与IBGC发病之间的关系，我们从上述13个突变中选择6个突变（p.Ser601Trp，p.Ser601Leu，p.Thr595Met，p.Glu575Lys，p.Gly498Arg和p.Val42del）进行功能研究。在非洲爪蟾卵母细胞中分别表达野生型及突变型PiT2转运体，然后进行放射性无机磷（32Pi）吸收实验，发现突变型转运体发生磷转运障碍。为验证SLC20A2突变是否具有显性负效应，我们将野生型与突变型（p.Ser601Gln或p.Glu575Lys）转运体在非洲爪蟾卵母细胞中进行共表达，并进行32Pi吸收实验，发现突变型转运体并未影响野生型转运体的磷转运功能，证实SLC20A2突变的致病基础是PiT2转运体单倍剂量不足。 本研究共在IBGC患者中鉴定出13个SLC20A2突变。统计发现SLC20A2突变率在 IBGC家系患者中为41.7％，在散发患者中则为9.1%，因此认为该基因为 IBGC主要的致病基因。SLC20A2突变导致的 IBGC在临床上可有两种表现层次：其中一种为脑部钙化的形成，另一种则为临床症状的出现。所有突变携带者在神经影像上均可观察到有脑钙化现象，外显率100%。但并非所有突变携带者都会表现出临床症状，本研究中SLC20A2突变的临床外显率为60.6%。IBGC是一种具有高度临床异质性的疾病，且患者的临床症状类型、发病时间以及严重程度在家系内和家系外均有较大差异。对本研究中 IBGC患者基因型与临床表型关系进行分析，发现携带相同突变的 IBGC患者可能会表现出类似的临床症状以及相近的发病年龄。此外，携带SLC20A2基因双突变患者的临床症状比只携带单突变的患者更为严重。总之，本研究克隆了IBGC第一个致病基因SLC20A2，并对SLC20A2突变与IBGC发病机制之间的关系进行了分析。这一发现将 IBGC与人大脑中磷稳态的失衡联系起来，为今后IBGC的分子致病机制研究以及药物开发奠定了理论基础。