肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在中国肝癌的发病率居肿瘤发病率的第三位,而其死亡率居第二位。虽然对肝癌防治的研究己取得巨大进展,根治切除术后的十年生存率已提高到30%左右,但肝癌根治性切除术后5年转移复发率仍为60-70%,即使是小肝癌也达43.5%。转移复发已成为进一步延长肝癌患者生存期、提高远期疗效的瓶颈,也是最终攻克肝癌的关键。探求转移复发相关的分子模型可以为肝癌患者预测临床结果提供有益信息,并为术后甄别需要接受辅助治疗的患者提供帮助。肝癌转移复发是多因素、多步骤参与的病理过程,是肿瘤细胞自身基因改变和宿主微环境相互作用的结果。迄今,尚无一个基因或基因组合能够用于临床预测肝癌预后,基于传统的临床指标和分期只能粗略区分不同分期的肝癌,无法满足临床实践中个体化治疗越来越高的要求。研究肝癌本身生物学特性和宿主免疫相关因素可能更利于理解肝癌转移复发的机制以及临床预测。本所前期采用全基因组微阵列技术,先在肝癌组织中的发现并建立了153个基因的肝癌转移复发预测模型,后又在癌旁组织建立了由17个炎症免疫相关细胞因子构成的分子预测模型可以准确预测肝癌术后复发。本研究在前期工作的基础上,从基因、蛋白各水平进一步验证和优化整合基于癌和癌周组织以及血清的预测标签、评估其对肝癌术后转移复发和生存的预测价值以及对术后复发的监测意义,探索它们向临床应用转化的可行性。第一部分基于组织的肝癌转移复发预测模型的优化整合与临床转化一.基于癌组织的肝癌转移复发预测模型的验证与优化目的：肝癌患者预后预测仍然困难,本课题组前期研究发现基于癌组织的153个基因的预测模型可以预测肝癌术后转移复发。本研究拟进一步在大样本中验证优化此模型,检验其对肝癌根治术后转移复发的预测效能。方法：应用生物信息学和统计学方法从基于癌组织的153个预测模型中筛选出26个与复发转移密切相关的分子,采用qRT-PCR检测训练组361例患者肝癌组织中这26个基因的mRNA表达水平。进一步优化构建有效的分子预测模型,分析其与肝癌术后转移复发的关系,并在288例患者的验证组中评估预测效能；并对其中重要基因在细胞系水平进行了验证。结果：在训练组361例肝癌患者中应用log-rank法分别检验26种基因与转移复发的关系,按关系的大小排序SPP2(P<0.01),ENO2(P<0.01),ASPH(P<0.01), FKBP10(P<0.01)及SAFB2(P<0.01)依次为前5位。基于Cox风险比例回归模型发现包含这5个基因的预测模型可以较准确地预测该组361例患者的复发情况(HR=1.98,95%CI=1.52-2.59；P<0.001),并且可作为肝癌术后总体生存期预测指标。根据该模型将验证组288例患者分为高风险组和低风险组,Kaplan-Meier分析显示高风险组中位至复发时间显著短于低风险组(HR=1.3795%CI=1.03-1.82；P=0.032),高风险组中位总生存期也短于低风险组(P<0.05)。在不同肝癌细胞株中EN02与ASPH的蛋白表达水平随着细胞转移潜能的增加而升高。结论：前期从基因芯片中筛选出的153个基因,经qRT-PCR大样本验证优化为5基因的预测模型可以较准确预测肝癌术后转移复发。二.基于癌旁组织的肝癌预后预测模型的验证与优化目的：进一步在大样本中验证优化前期基于癌旁组织的免疫炎症相关因子的预测模型,评估其对肝癌根治术后转移复发和生存的预测价值。方法：我们随机选取了3组在复旦大学附属中山医院行根治性手术切除的肝细胞癌患者,包括训练组180例,验证A组200例及验证B组188例。在训练组利用荧光定量PCR技术,优化验证癌旁(IL-6、CSF-1、SPP1、TNF及HLADRA)5基因预测模型,然后在验证A组中对该模型进行验证；在验证B组中利用组织芯片、免疫组织化学技术,验证“癌旁5基因预测模型”的稳定性、有效性。结果：在训练组180例肝癌患者中应用log-rank法检验10个与肝癌预后密切相关的因子,排序后IL-6,CSF-1,SPP1,TNF和HLADRA为前5位,应用这5个免疫炎症相关细胞因子可以区别肝癌患者预后。基于Cox风险比例回归模型发现包含这5个基因的预测模型可以较准确地预测训练组患者中位总生存情况(HR=2.19,95%CI=1.55-3.08;P<0.001)。验证A组200例患者根据阈值被分为高风险组和低风险组,Kaplan-Meier分析显示高风险组中位生存期显著短于低风险组(HR=1.37,95%CI=1.03-1.82；P<0.001)。利用免疫组织化学技术证实验证B组中CSF-1,SPP1,TNF和HLADRA的蛋白表达水平与mRNA一致。结论：前期的基于肝癌癌旁组织的预测模型经大样本qRT-PCR验证优化为5基因的预测模型可以较准确预测肝癌术后生存情况。三.癌与癌旁转移复发分子预测模型的整合与临床转化目的：整合基于癌和癌旁组织的预测模型,在前瞻性研究队列中进一步评估其预测价值及临床应用的可行性,组装预测试剂盒。方法：续贯纳入的368例原发性肝癌患者作为前瞻性队列,具有癌与癌旁配对组织样本。应用Kaplan-Meier法比较不同组间的总生存时间(OS)和至复发时间(TTR)差异,应用Harrell一致性指数(C-index)比较两模型及其与传统临床分期的预测准确性,进而优化整合提出更为准确的预测模型。结果：根据基于癌或癌旁组织的预测模型所将纳入研究队列的患者归类为高风险组或低风险组,临床随访观察其复发和生存情况,将预期与实际情况对比。研究发现根据预测模型划分的高风险患者较低风险患者术后转移复发p<0.05)及死亡p<0.05)的危险均明显增高。一致性指数(C-index)比较预测准确性发现基于癌组织的预测模型对复发的预测效果更好,基于癌旁组织的预测模型则对生存预测效果较好。将两者都整合到现有临床分期系统之后,效能进一步提高,并组装可用于临床的预测试剂盒。结论：基于癌与癌旁组织的预测模型在前瞻性队列中能较为准确的预测肝癌术后转移复发与生存,将其与现有临床分期整合可以提高预测效能。第二部分血清OPN在肝癌术后的动态变化及其对肝癌复发监测的意义目的：术前血清骨桥蛋白(OPN)已经被证明与肿瘤的预后密切相关,本研究旨在探索肝癌术后血清OPN动态变化及其在肝癌术后复发监测中的意义。方法：本研究中,我们随机选取了分别于不同时段(2005年1月-2007年12月,179例,为A组)(2010年2月-2011年12月,110例,为B组)在复旦大学附属中山医院行根治性手术切除的两组肝细胞肝癌患者,以及另一个包括慢性肝病、肝脏良性肿瘤、正常健康人及转移性肝癌患者的对照组。收集其血清样本,采用酶联免疫法ELISA检测OPN的水平。A组和对照组用来确定患者术前OPN的基线水平；B组患者检测了术前、术后1周、术后1月及术后超过2月的OPN水平,用来分析患者术后OPN的动态变化。结果：A组术前血清OPN的基线水平为164.3±18.6ng/mL与B组的基本一致,两组OPN的水平明显高于对照组中的慢性肝病(p<0.0001)、转移性肝癌(p<0.0001)以及肝脏良性肿瘤(p<0.0001)的患者。在B组中术后1周的血清OPN水平(214.4±14.1ng/mL)明显高于术前水平,但在术后1月时回落到近似于慢性肝病组水平(47.6±5.4ng/mL),术后2月下降到最低值(36.3±5.9ng/mL)。肝癌复发时,血清OPN水平再次升高,而当复发的肿瘤再次被手术切除后,OPN水平又开始下降,呈现与第一次手术后一致的现象。而且无论在甲胎蛋白(AFP)阴性或阳性的患者中都呈现这一变化模式。术后血清OPN水平与肝功能及C反应蛋白水平相关。结论：肝癌患者血清术前OPN水平较对照明显升高,并在术后经短暂升高后约5周后逐渐下降；当肝癌复发时血清OPN再次升高并且AFP阴性患者也有此规律,因此肝癌术后血清OPN变化可以作为肝癌根治术后病程观察和监测复发的依据。全文总结1.经验证优化后,基于肝癌组织的5基因的预测模型能较为准确的预测肝癌术后复发,癌旁组织中的5基因的预测模型能较为准确的预测肝癌术后生存,经大样本前瞻性验证具有临床应用价值。2.肝癌患者血清术前OPN水平较正常人及肝硬化患者明显升高,并在术后经短暂升高后约5周逐渐下降；当肝癌复发时血清OPN再次升高并且AFP阴性患者也有此规律,肝癌术后血清OPN变化可以作为肝癌根治术后病程观察和监测复发的依据。创新点1.验证优化整合得出稳定的基于癌与癌旁组织的肝癌转移复发预测模型。2.开发并组装了预测肝癌术后转移复发与生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒。3.首次报道肝癌患者血清OPN可替代AFP作为肝癌术后转移复发的检测指标。潜在应用价值1.优化验证整合癌组织153基因模型和癌周17个免疫因子预测模型,得出确实可信、实用的模型,向临床转化迈出了坚实的一步。2.本研究中已经申请国家专利2项：“预测肝癌术后转移与复发的实时PCR微阵列芯片试剂盒”,专利申请号：201110091076.6；“预测肝癌术后生存的实时定量PCR微阵列芯片试剂盒”专利申请号：201110091077.0,并已着手开发组装了该预测试剂盒。3.肝癌术后血清OPN变化可以作为肝癌根治术后病程观察和监测复发的依据。