目的:观察microRNA-7过表达对小鼠胸腺CD8⁺SP细胞发育的影响并初步探讨其分子机制。方法:1.利用分子生物学技术构建miR-7（microRNA-7,miR-7）真核表达载体;利用显微胚胎注射技术成功构建miR-7过表达（miR-7 overexpression,miR-7 OE）小鼠。常规剪取7只F0代miR-7 OE小鼠尾巴（0.5-1cm）,按照小鼠基因型鉴定试剂盒抽提DNA,同时,剪取一只野生型（wild-type,WT）小鼠尾巴作为阴性对照。利用特异性引物,采用PCR技术扩增目的基因片段。2.提取WT和miR-7 OE小鼠的心脏、肝脏以及脾脏等11个不同组织器官的总RNA,用miR-7特异性引物逆转录成cDNA,利用Real-time PCR茎环法检测各组织器官中miR-7成熟体的表达水平。3.观测并记录WT和miR-7 OE小鼠从2周龄到9周龄的体重变化;HE染色观察8周龄WT和miR-7 OE小鼠心脏、肺脏以及肝脏等重要脏器的组织学结构改变。4.分别检测4周龄和8周龄WT和miR-7 OE小鼠胸腺大小、重量以及细胞总数的变化;HE染色观察各组小鼠胸腺的组织学结构改变。5.利用流式细胞术（Fluorescence-activated cell sorter,FACS）检测各组小鼠胸腺细胞各亚群的比例变化;并进一步检测胸腺CD8⁺SP细胞表面活化分子CD44、CD62L以及CD69的比例。同时,利用核抗原Ki67染色法和PI法检测各组小鼠胸腺CD8⁺SP细胞的增殖以及凋亡比例。6.体外培养8周龄WT和miR-7 OE小鼠胸腺细胞,利用anti-CD3/CD28抗体进行体外刺激,72 h后利用FACS检测两组小鼠胸腺CD8⁺SP细胞表面活化相关分子CD44、CD62L以及CD69的比例;并利用核抗原Ki67染色法和PI法检测其增殖和凋亡比例。7.采用过继细胞转输（Adoptive cell transfer,ACT）实验:分别取CD45.1^+/+和CD45.1⁺miR-7 OE小鼠骨髓细胞,通过尾静脉过继转输入Rag1^-/-小鼠体内,7天后取其胸腺,利用FACS检测其CD45.1⁺胸腺细胞各亚群比例及绝对数。8.利用cDNA基因芯片技术检测WT和miR-7 OE小鼠胸腺组织中全基因表达情况。根据基因芯片结果,并结合一些靶分子预测软件如miRbase、TargetScan、miRWalk等,利用维恩分析筛选出miR-7可能作用的靶分子;利用Real-time PCR技术检测这些可能靶基因的mRNA表达水平,结合文献报道情况,最终确定miR-7作用的靶分子。9.FACS检测miR-7 OE小鼠胸腺CD8⁺SP细胞中靶分子的表达,以及相关信号通路,包括AKT、ERK、p-AKT以及p-ERK的水平变化。结果:1.酶切及测序结果显示:miR-7真核表达载体成功构建;随后,该载体送至赛业（广州）生物科技有限公司构建miR-7 OE小鼠,最终得到7只F0代小鼠,PCR结果显示:F0代小鼠鼠尾DNA中可扩增出492bp的目的片段,提示成功构建F0代miR-7OE小鼠。2.Real-time PCR结果显示:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠脾脏、肾脏、脑等淋巴器官以及重要脏器中miR-7成熟体的表达水平均明显上调（P﹤0.05）,提示miR-7 OE成功构建后能够稳定传代。3.miR-7 OE小鼠较WT小鼠体重明显增加（P﹤0.05）;且体型略大;HE染色结果显示:各重要组织器官均无明显的组织学结构改变。4.在4周龄小鼠中:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠的胸腺大小、重量以及细胞总数均无明显改变。在8周龄小鼠中:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠的胸腺大小、重量以及细胞总数均明显增加（P﹤0.05）;HE染色结果显示:与相应周龄的WT小鼠相比,4周龄和8周龄miR-7 OE小鼠的胸腺结构并未发生明显的组织学结构改变。5.FACS检测结果显示:与相应周龄的WT小鼠相比,4周龄miR-7 OE小鼠的胸腺细胞各亚群比例均无明显改变;8周龄miR-7 OE小鼠的胸腺细胞各亚群变化如下:CD4⁺CD8⁺双阳性（Double Positive,DP）细胞、CD4⁺单阳性（Single Positive,SP）、CD8⁺SP细胞的比例均无明显改变,而它们的绝对数均明显增加（P﹤0.05）;同时,CD4^-CD8^-双阴性（Double Negative,DN）细胞的比例明显减少（P﹤0.05）,其绝对数则无明显改变。6.FACS检测结果显示:与WT小鼠相比,8周龄miR-7 OE小鼠胸腺CD8⁺SP细胞的增殖、活化以及凋亡变化如下:CD62L的比例明显减少;CD69和CD44的比例明显增加;此外凋亡比例明显减少,而Ki67的比例则明显增加（P﹤0.05）。7.体外实验显示:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠的胸腺细胞克隆团明显增加;FACS检测结果与相应的体内实验结果相似。8.ACT实验结果显示:与对照组小鼠相比,CD45.1⁺miR-7 OE组小鼠胸腺细胞各亚群比例变化如下:CD8⁺SP细胞的比例及绝对数均明显增加（P﹤0.05）;DN、DP、CD4⁺SP细胞的比例无明显改变,它们的绝对数改变也无统计学意义。9.cDNA基因芯片结果显示:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠胸腺组织中存在大量的差异表达基因。结合miRbase、TargetScan、miRWalk等靶分子预测软件分析,筛选出24个候选靶分子,同时,结合文献报道,最后筛选出PIK3R1、POU2F1、SLC38A2、BBX、RAB7、ARF4、PIK3CA等7个候选靶分子。10.Real-time PCR结果显示:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠胸腺组织中,这7个候选靶分子的表达水平均下调（P﹤0.05）;且PIK3R1和PIK3CA的表达水平下调最明显,再结合文献报道提示,最终选定PIK3R1为影响miR-7调控胸腺CD8⁺SP细胞发育的靶分子。11.FACS检测结果显示:与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠胸腺CD8⁺SP细胞中,PIK3R1的表达水平下调（P﹤0.05）;同时,与WT小鼠相比,miR-7 OE小鼠胸腺CD8⁺SP细中,AKT、ERK的表达水平均无明显改变;而p-AKT的表达水平明显增加,p-ERK的表达水平明显减少（P﹤0.05）。结论:MiR-7过表达可显著影响小鼠胸腺CD8⁺SP细胞发育,该效应与其靶分子PIK3R1的表达下调和AKT、ERK信号途径传递变化有关。