SERCA2中674位半胱氨酸的失活与主动脉平滑肌细胞线粒体功能障碍的关系及机制研究

来源 :重庆大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:weishaohua1982
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线粒体是真核细胞进行有氧呼吸释能的中心,与细胞中钙稳态的维持、自由基的产生、信号转导和生长周期的调控以及自噬和凋亡息息相关。线粒体渗透转变、细胞内钙离子(intracellular Ca2+,[Ca2+]I)水平异常、电子传递链损伤、线粒体酶活性异常、线粒体DNA损伤以及线粒体自由基的过度生成和积聚等均可引起细胞内的能量代谢紊乱,导致线粒体功能障碍。线粒体功能异常直接影响细胞的正常功能,导致多种代谢疾病的发生。因此,明确线粒体功能障碍的分子机制对于相关疾病的防治尤为关键。
  肌浆网/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)的主要作用是主动将[Ca2+]I转运至肌浆网和内质网(endoplasmic reticulum,ER),是细胞内调控Ca2+的关键酶,对于细胞内钙稳态和ER稳态的维持至关重要。SERCA2是心血管系统中SERCA的主要亚型,其第674位半胱氨酸(cysteine674,C674)是调节SERCA2功能的一个主要氧化还原位点。我们通过对动脉粥样硬化、腹主动脉瘤等组织样品的分析发现,导致氧化应激的病理情况都引起SERCA2C674的不可逆性氧化(C674-SO3H)失活。为了模拟病理情况下该位点的不可逆性氧化失活,我们将SERCA2第674位的半胱氨酸突变成丝氨酸(C674→S674),构建了SERCA2C674S基因敲入鼠(SERCA2C674S knock-in mice,SKI),来自同窝(无S674)的野生型小鼠(wild type mice,WT)作为对照。纯合子SKI具有胚胎致死性。杂合子SKI(以下简称SKI)含有一半C674和一半S674,模拟了C674在病理情况下的部分失活(以下简称C674失活)。在主动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC),C674失活明显增加[Ca2+]I和线粒体钙离子(mitochondrial Ca2+,[Ca2+]M),抑制线粒体腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的合成,增加活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的蓄积,表明C674失活引起线粒体功能障碍。本课题主要从主动脉SMC的角度分析SERCA2C674失活与线粒体功能障碍的关系及相关调控机制,为临床上相关疾病的防治提供新的理论依据和干预靶点,具有很好的应用价值。主要研究内容如下:
  ①C674失活通过干扰细胞内钙稳态诱导内质网应激,影响细胞能量代谢
  SERCA是将Ca2+从胞浆摄入到肌浆网/ER的关键酶,ER是细胞内最大也是最主要的钙库,对于维持细胞的正常功能至关重要。在主动脉SMC,我们发现C674失活明显增加[Ca2+]I,激活IRE1α、PERK和ATF6信号通路,诱导ER应激。进一步研究发现,C674失活导致[Ca2+]M超载,降低线粒体跨膜电位(mitochondrialtransmembrane potential,Δψm),抑制AMP依赖性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化,进而影响脂肪酸β氧化途径相关蛋白乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase1,ACC1)的磷酸化,下调肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoyl transferase1A,CPT-1A)的蛋白表达。同时,C674失活下调氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)途径相关蛋白的表达,包括ATP合成酶F0亚基6(ATP synthase F0subunit6,ATP6)、细胞色素C氧化酶Ⅱ(cytochrome c oxidaseⅡ,MT-CO2)和细胞色素C氧化酶IV(cytochrome c oxidaseⅣ,COXIV)及NADH脱氢酶核心亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1),表明C674失活通过干扰细胞内钙稳态,导致细胞能量代谢紊乱,诱导线粒体功能障碍。抑制ER应激(4-PBA和4?8c)和激活AMPK(AICAR和二甲双胍),均可以明显缓解C674失活对脂肪酸β氧化和OXPHOS途径相关蛋白表达的影响,表明C674失活可以通过诱导ER应激和抑制AMPK活性阻断细胞内能量代谢。
  ②C674失活抑制线粒体ATP的生成
  荧光碳量子点作为一种新型荧光碳纳米材料,由于其光稳定性好、光不闪烁、不漂白等优点,被广泛用于生物医药领域。我们以聚乙烯亚胺和聚丁烯四羧酸酐为原料,以乙醇作为溶剂,水热法制备了具有大共轭平面且带正电性的绿色单层石墨烯量子点(single-layered graphene quantum dots,s-GQDs)。由于ATP具有带负电的三磷酸部分和芳香共轭腺嘌呤,该s-GQDs通过π-π堆积和静电作用与ATP特异性结合,s-GQDs聚集导致荧光猝灭。同时,由于s-GQDs具有一定程度的疏水性和正电性,s-GQDs主要富集在线粒体,可用于线粒体中ATP的实时分析。为了进一步考察SERCA2C674失活对主动脉SMC能量代谢的影响,我们利用该s-GQDs对WT和SKI主动脉SMC中ATP进行实时成像分析。结果发现,与WT相比,SKI主动脉SMC中s-GQDs荧光强度明显增加,表明C674失活抑制ATP的生成;而抑制ER应激可以明显缓解C674失活对细胞ATP生成的影响,表明C674失活诱导的ER应激参与了对ATP生成的调控。
  ③C674失活促进ROS的生成,诱导细胞凋亡
  线粒体是细胞内产生ROS的主要场所,同时也是受ROS攻击的主要细胞器。我们发现C674失活明显增加主动脉SMC中ROS的水平,抑制线粒体抗氧化酶活性,诱导细胞凋亡。在SKI主动脉SMC,超氧化物清除剂Tempol降低ROS的水平,抑制细胞凋亡,缓解C674失活对细胞OXPHOS和脂肪酸β氧化的抑制,增加ATP的生成。这些结果表明C674失活通过增加ROS的生成参与了线粒体能量代谢异常,而抑制ROS的过量生成改善C674失活介导的能量代谢紊乱。另外,我们发现激活AMPK可以缓解C674失活引起的氧化应激,促进线粒体能量代谢。
  综上所述,SERCA2中C674失活导致钙调控紊乱,诱导ER应激和氧化应激,干扰线粒体能量代谢,引起线粒体功能障碍。
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