目的本研究以建立绿色荧光蛋白和双荧光素酶基因的RNA干扰体系为模型,对中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）的RNAi抑制因子进行筛选,探讨CSBV逃避RNAi作用过程可能机制,并通过凝胶迁移实验、GST pull-down和Far-western blotting实验进行验证,明确CSBV的RNA干扰抑制因子,为CSBV的致病机理提供新的思路。方法psh RNA-GFP和GFP-si RNA分别与绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）重组质粒p EGFP-N1共转染至293T细胞中,利用荧光显微镜和Western blot检测p EGFP-N1质粒在293T细胞中荧光强度和蛋白表达情况,并以番茄丛矮病毒P19蛋白的重组质粒p SG5m P19作为阳性对照,建立了GFP RNAi体系。以该RNAi体系为基础,分别将CSBV结构蛋白重组质粒p TT5-VP1、p TT5-VP2和p TT5-VP3与psh RNA-GFP和p EGFP-N1质粒,与GFP-si RNA和p EGFP-N1共转染293T细胞,筛选具有RNAi抑制功能的CSBV结构蛋白VPX。为定量分析VPX的抑制效率,将双荧光素酶（Luc）的psh RNA-Luc及si RNA-Luc分别与PGL3和p RL-TK共转染293T细胞构建双荧光素酶RNAi体系。通过该体系,将p TT5-VPX分别与psh RNA-Luc、PGL3和p RL-TK共转染293T细胞,与si RNA-Luc、PGL3和p RL-TK共转染293T检测VPX的抑制效率。在此基础上,为探讨VPX作用机制,将中华蜜蜂幼虫Dicer酶、不同长度的p GL3双链RNA（ds RNA-p GL3）与VPX纯化蛋白共同孵育后,通过凝胶迁移实验（EMSA）检测蛋白VPX蛋白对Dicer酶切割功能的影响。同时,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-Ago2,进行蛋白纯化后,通过GST pull-down和Far-western blotting实验验证Ago2与蛋白VPX是否存在相互作用。结果通过荧光显微镜和Western blot实验检测建立的RNAi体系,GFP蛋白在293T细胞中荧光强度显著减低、表达水平显著下调,而加入P19蛋白后绿色荧光强度得到恢复,表明成功构建了GFP表达RNAi体系。然后,利用该体系对CSBV结构蛋白VP1、VP2和VP3抑制作用进行筛选,结果显示结构蛋白VP3能够显著恢复sh RNA抑制的绿色荧光强度及GFP蛋白的表达水平,表明CSBVVP3蛋白具有抑制RNAi的功能。为定量分析VP3的抑制效率,在构建的Luc表达RNAi体系中,分别加入psh RNA-Luc质粒和合成的三条Luc的si RNA1、siRNA2和siRNA3,均能抑制双荧光素酶的活性,其中psh RNA-Luc和PGL3（pRL-TK）比例为0.5:1时抑制率可以达到60%,合成的三条Luc的si RNA中siRNA3抑制率最高,达到79%,加入pTT5-VP3质粒后,被sh RNA抑制的双荧光素酶活性恢复至149%,而被si RNA3抑制的双荧光素酶活性恢复不明显。为进一步研究VP3对RNAi抑制的可能机制,通过对p GEX-6p-1-Ago2和pET-28a-VP3进行GST pull-down和Far-western blotting实验,对Dicer酶、重组蛋白VP3共同孵育后进行EMSA实验,结果表明VP3能够抑制Dicer酶活性,发挥对RNAi的抑制作用。结论1、分别利用GFP和双荧光素酶基因RNAi体系对CSBV结构蛋白抑制RNAi作用进行研究,结果表明CSBV结构蛋白VP3具有RNAi抑制功能。2、CSBV结构蛋白VP3对RNAi抑制作用主要是通过抑制Dicer酶活性,影响Dicer对ds RNA切割能力,进而抑制RNAi功能。