研究背景：　　 癌症作为当今世界的主要死亡原因之一，近年来呈逐年上升趋势。肿瘤对人体的危害不仅限于原发灶对机体造成的，而更重要的是肿瘤的侵袭和转移，其是造成患者死亡的主要原因。尽管医疗技术水平不断提高，但对于肿瘤早期转移的发现和晚期转移的治疗仍然缺乏强而有效的措施。因此为了进一步研究肿瘤的各种相关机制及其进一步治疗措施，建立与临床表现相近的肿瘤动物模型是非常有必要的。　　 在肿瘤动物模型，尤其是肿瘤转移模型发展过程中有两个重要思想，即原位移植战略和肿瘤细胞异质论.原位移植战略是指将人类肿瘤接种到与肿瘤原发部位相对应的移植宿主器官组织内，使其获得与人体肿瘤相似的微环境；肿瘤细胞异质论认为在同一肿瘤内含有生物学特性和转移行为不完全相同的各种细胞亚群，转移能否发生在很大程度上取决于具有转移能力的极少部分细胞能否转变成占优势的肿瘤细胞亚群。本课题利用T细胞免疫缺陷的裸小鼠进行了人宫颈癌细胞(SiHa、CaSki、HeLa)、卵巢癌细胞(Skov3、A2780)多水平、多层次的接种移植，对其进行生物学特性观察，并根据肿瘤细胞异质论筛选出了具有高淋巴转移潜能的人宫颈癌(SiHa)细胞亚群，建立了相应动物模型。　　 利用生物发光(如荧光素酶)或荧光激发(如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)检测系统进行活体细胞示踪，通过配有活体显微镜的体外显影技术能够对疾病从少量细胞到大块肿瘤的全过程进行定量分析，使人们能够在活体动物体内观察肿瘤的侵袭转移过程。另外，还可运用多种荧光蛋白追踪个别动物的特殊细胞群以减少动物之间的差异。本试验利用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)基因的慢病毒载体感染人宫颈癌SiHa、CaSki细胞，获得稳定表达EGFP的宫颈癌细胞，建立了整体可视化宫颈癌原位移植动物模型。　　 目的：　　 1、在人癌试验基础上建立多种裸鼠宫颈癌、卵巢癌动物模型，为研究妇科恶性肿瘤淋巴转移机制、早期诊断以及治疗奠定良好的动物学基础。　　 2、通过细胞转染技术建立裸鼠宫颈癌原位移植肿瘤及其淋巴结转移的整体可视化模型，使人们可以在活体状态下观察肿瘤的演进规律。　　 3、对已标记EGFP的人宫颈癌(SiHa)细胞系在裸鼠体内外连续传代及原代培养，筛选出具有高淋巴转移潜能的宫颈癌细胞亚群。　　 方法：　　 1、常规复苏、培养宫颈癌(SiHa、CaSki、HeLa)细胞株、卵巢癌(Skov3、A2780)细胞株，进行皮下接种后密切观察其皮下成瘤情况。　　 2、利用含EGFP基因的重组慢病毒(lentivirus)转染宫颈癌SiHa、CaSki细胞，流式细胞仪检测、筛选获得稳定表达EGFP的宫颈癌细胞，用获得稳定转染的细胞进行裸小鼠尾根部注射，待其出现衰竭体征时在整体荧光成像仪提示下取远处转移灶及淋巴结原代培养，培养筛选出细胞再次鼠尾根部注射，上述过程重复3次筛选出具有高淋巴转移潜能的宫颈癌SiHa细胞亚系。　　 3、将筛选出的高转移潜能宫颈癌SiHa/EGFP细胞接种到裸小鼠皮下，待皮下瘤长至0．3-0．5cm3大小时取出、剪至1mm3大小碎片皮下移植，重复上述过程3次，用第三代皮下瘤进行裸小鼠宫颈水平位置原位移植。借助整体荧光体视镜和IPPS．0软件，采集分析EGFP发出的荧光信号，在动物活体内实时观察宫颈癌局部成瘤及转移情况，并应用常规病理学方法进行评价和鉴定。　　 4、将人卵巢癌Skov3细胞接种到裸鼠皮下形成卵巢癌裸鼠皮下瘤，取出皮下瘤并剪成1-2mm3大小的组织块，接种至另一裸小鼠一侧卵巢，建立人卵巢癌原位移植模型。　　 结果：　　 1、建立了稳定表达EGFP的宫颈癌SiHa、CaSki细胞系，筛选出具有高淋巴结转移潜能的宫颈癌SiHa细胞亚群，建立了整体可视化宫颈癌高转移动物模型。可以观测到宫颈癌肿瘤首先长入整个生殖道，形成较大局部包块，侵犯局部淋巴结，远处淋巴结，后来转移至肺和其他脏器。而且发现肿瘤大小与转移范围呈正比关系。　　 2卵巢癌细胞Skov3皮下注射、原位移植成瘤率100％。原位移植卵巢癌首先在局部形成包块，与周围组织发生粘连，造成局部侵犯，晚期小鼠消瘦、皮肤苍白、腹腔积液伴腹腔广泛种植性转移。　　 3、宫颈癌细胞株(SiHa、CaSki、HeLa)单细胞悬液(2×106个/只)皮下、尾根部注射及组织块原位移植成瘤率均100％。细胞悬液皮下注射接种时，同种细胞、同时间点、同细胞数接种成瘤时间不一，成瘤大小不均，成瘤后瘤块生长速度因肿瘤细胞类型不同而不同，生长速度最快的为HeLa，其次CaSki，最慢的为SiHa。　　 4、本实验共对5只荷瘤鼠的皮下瘤进行了部分切除，手术后发现原发瘤明显充血并急速增大，均在8-15天内死亡。　　 5、宫颈癌HeLa细胞皮下接种4只(其中1只为雄性)，接种后3只雌性鼠平均寿命34天，另一只雄性鼠寿命为46天，且肿瘤生长缓慢，体积明显小于雌性鼠。　　 结论：　　 1、建立了与临床表现相似的妇科肿瘤动物模型，为深入研究肿瘤淋巴转移机制、探索新型影像造影剂、对具有潜在可能性治疗方法的评估奠定了良好的动物学基础。　　 2、建立了稳定表达EGFP的宫颈癌SiHa细胞系，并利用体内、外连续传代、筛选和原代培养的方法分选出具有高转移潜能宫颈癌细胞亚群，建立相应动物模型。　　 3、在整体荧光成像系统提示下，发现宫颈癌原位移植瘤早期为局部淋巴结转移，后出现远处转移并侵犯临近脏器，再转移到肺或其他脏器。　　 创新点：　　 在人癌实验层次基础上进行了多水平、多层次的妇科恶性肿瘤动物模型的建立，为深入研究肿瘤淋巴转移机制、探索新型影像造影剂及对具有潜在可能性治疗方法的评估提供了一个强有力的武器。