【摘 要】
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目的:研究胃癌细胞来源外泌体（Exosome,Exo）对肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）表型转化的影响,探讨肝星状细胞活化对胃癌细胞恶性生物学行为的作用及其分子机制。方法:1.采用聚合物沉淀结合超滤法提取纯化胃癌细胞AGS分泌的外泌体,通过蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测标志蛋白,透射电镜（Transmission electron micro
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目的:研究胃癌细胞来源外泌体（Exosome,Exo）对肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）表型转化的影响,探讨肝星状细胞活化对胃癌细胞恶性生物学行为的作用及其分子机制。方法:1.采用聚合物沉淀结合超滤法提取纯化胃癌细胞AGS分泌的外泌体,通过蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测标志蛋白,透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察形态特点,纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）检测颗粒直径,验证其是否符合定义外泌体的相关指标。2.应用荧光染料PKH26标记外泌体、DAPI标记肝星状细胞LX-2,通过荧光示踪方法观察肝星状细胞LX-2对外泌体的摄取。3.利用提取的胃癌细胞分泌外泌体与肝星状细胞LX-2共孵育,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测外泌体干预后肝星状细胞LX-2中α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和成纤维细胞激活蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）的mRNA表达水平,确实肝星状细胞LX-2表型转化即肝星状细胞活化成为肿瘤相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblasts,CAFs）。4.运用细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）细胞增殖实验、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、划痕实验等观察肝星状细胞LX-2活化对胃癌细胞恶性生物学行为作用。5.选用Western blot检测肝星状细胞LX-2活化对胃癌细胞上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关基因蛋白表达影响。结果:1.采用聚合物沉淀结合超滤法成功提取纯化胃癌细胞分泌外泌体,经透射电镜观察、纳米颗粒跟踪分析、蛋白免疫印迹法鉴定,结果表明我们提取的颗粒物符合外泌体界定的相关指标,即为胃癌细胞来源的外泌体。2.应用荧光染料标记胃癌细胞分泌外泌体和肝星状细胞LX-2,通过荧光示踪方法成功观察到外泌体在肝星状细胞LX-2内富集,证实肝星状细胞LX-2可大量摄取外泌体。3.利用提取的胃癌细胞分泌外泌体与肝星状细胞LX-2共孵育,RT-qPCR检测肿瘤相关成纤维细胞标记物α-SMA和FAP的mRNA表达水平,结果显示二者表达水平均明显增高,确实肝星状细胞LX-2表型转化即肝星状细胞活化成为肿瘤相关成纤维细胞。4.运用CCK8细胞增殖实验和克隆形成实验发现肝星状细胞LX-2活化明显促进胃癌细胞增殖能力、增殖活力;Transwell侵袭和划痕实验发现肝星状细胞LX-2活化显著增强胃癌细胞侵袭、迁移能力。5.选用WB检测发现肝星状细胞LX-2活化促进胃癌细胞EMT相关上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达显著下调,间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）表达显著上调。结论:胃癌细胞来源外泌体可促进肝星状细胞表型转化,致肝星状细胞活化成为肿瘤相关成纤维细胞,且胃癌细胞来源外泌体致肝星状细胞活化后可明显诱导胃癌细胞产生上皮间质转化,显著增强胃癌细胞增殖、侵袭与迁移。
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