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在我国，子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，且其发病率逐年持续上升。约25%的子宫内膜癌病例在确诊时已属晚期，对化疗和内分泌治疗的客观反应率很低，预后不佳。然而,迄今我们对子宫内膜癌发生、进展及侵袭转移的分子机制尚不清楚。据报道,同源盒转录基因EMX2在雌性生殖系统发育中起关键作用，Emx2-/-雌性小鼠的生殖道（子宫、宫颈、阴道等）完全缺如。在绝经前子宫内膜中，EMX2的蛋白表达量随月经周期发生规律性改变，而绝经后子宫内膜中EMX2呈持续性高表达；同时，体外实验证实EMX2可拮抗正常内膜上皮细胞的过度增殖。课题组预实验发现约30%（10/30）的子宫内膜癌组织中EMX2表达显著下降，提示EMX2基因失活可能参与了子宫内膜癌的发生发展等过程。基于以上发现，本课题拟从以下四个方面对子宫内膜癌中EMX2基因的生物学功能及其作用机制进行探讨：（1）检测组织和细胞系EMX2mRNA和蛋白的表达水平,分析其与患者各临床病理参数之间的相关性；（2）应用甲基化特异性PCR(MSP)及DNA测序等技术检测子宫内膜癌中EMX2基因启动子区高甲基化的发生频率，确定DNA甲基化是否可导致EMX2表达下降，并在相应的子宫内膜癌细胞中进行验证；（3）在子宫内膜癌细胞中分别上、下调EMX2的表达，采用MTT、克隆形成、wound healing、Transwell、流式细胞术、real time PCR和western blot等方法检测EMX2基因对细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响；建立子宫内膜癌裸鼠荷瘤模型，体内验证EMX2对子宫内膜癌的抑制作用（；4）采用real time PCR、western blot检测EMX2对Wnt信号通路的影响，应用Wnt信号通路抑制剂(XAV-939)和激动剂(LiCl)验证Wnt信号是否为EMX2基因抗肿瘤作用的关键下游通路。第一部分EMX2在子宫内膜癌组织和细胞系中的表达目的：检测人子宫内膜癌组织和永生化子宫内膜癌细胞系中EMX2的表达水平，探讨EMX2表达与患者临床病理参数之间的相关性。方法：应用免疫组织化学方法技术检测正常内膜组织（n=25）、子宫内膜癌组织（n=122）中EMX2蛋白的表达和定位。应用real time PCR、western blot检测子宫内膜癌细胞系中EMX2mRNA和蛋白的表达水平。应用SPSS软件分析EMX2表达与患者临床病理参数之间的相关性。结果：(1)与正常内膜相比，48.4%（59/122）的子宫内膜癌组织中EMX2蛋白表达下降（P <0.001）。EMX2表达下降与肿瘤分期(P=0.023)、分级(P=0.016)、深肌层浸润(P=0.04)密切相关，与年龄、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结侵犯以及雌孕激素受体状态无相关性。(2)在正常内膜组织中，EMX2蛋白主要定位于细胞核，部分可伴细胞浆同时着色。在子宫内膜癌组织中未见EMX2蛋白着色部位的异常。(3) KLE、Ishikawa细胞中EMX2表达较高，RL95-2、AN3CA、SPEC-2细胞中EMX2表达极低。结论：EMX2在子宫内膜癌组织中频发失活，且与肿瘤恶性程度明显相关，提示EMX2失活可能参与了子宫内膜癌的发生、进展。第二部分子宫内膜癌中EMX2基因失活机制目的：探讨人子宫内膜癌中EMX2基因失活的机制。方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)及测序技术检测子宫内膜癌细胞系（n=4）、正常内膜（n=22）和子宫内膜癌组织（n=79）中EMX2基因启动子区发生甲基化的频率；应用甲基化逆转药物5-AZA-dC处理子宫内膜癌细胞，采用real time PCR、western blot分别检测细胞内EMX2mRNA和蛋白水平的改变。结果：(1)在正常内膜和子宫内膜癌组织中，EMX2基因启动子高甲基化的发生率分别为4.5%（1/22）和39.2%（32/79，P <0.001），且高甲基化与EMX2表达失活明显相关(P <0.001)。(2)仅RL95-2细胞中存在EMX2启动子高甲基化；经1μM5-AZA-dC处理12小时后，RL95-2细胞中EMX2mRNA和蛋白表达均明显上升，而其他3种细胞中EMX2表达无明显变化。结论：启动子高甲基化是导致子宫内膜癌中EMX2基因失活的一个重要因素，同时也提示EMX2可能是一个抑癌基因。第三部分EMX2基因对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响目的：探讨EMX2对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭和成瘤能力的影响。方法：使用pcDNA3.1-EMX2、siRNA-EMX2及它们的阴性对照对RL95-2和KLE细胞分别进行瞬时转染，应用MTT、克隆形成实验检测细胞增殖能力；应用流式细胞术检测细胞凋亡、周期的改变；应用划痕实验检测细胞迁移能力；应用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。应用pcDNA3.1-EMX2转染RL95-2细胞并用G418筛选、构建EMX2稳定高表达细胞株，应用该细胞株在裸鼠体内验证EMX2对肿瘤形成的影响。结果：(1)转染效果检测：瞬时转染pcDNA3.1-EMX2质粒后，RL95-2细胞中EMX2mRNA和蛋白水平均显著升高；瞬时转染siRNA-EMX2后，KLE细胞中EMX2mRNA和蛋白水平下降超过75%。(2)上调EMX2表达后，RL95-2细胞的增殖(P=0.002, MTT; P=0.03,克隆形成)、迁移(P=0.018)、侵袭(P=0.039)能力受到明显抑制；同时EMX2可将RL95-2细胞阻滞在G1期；但EMX2并不增加RL95-2细胞的凋亡率。而下调EMX2表达促进KLE细胞的增殖(P=0.025,MTT; P=0.011,克隆形成)、迁移(P=0.026)、侵袭(P=0.019)能力；下调EMX2后更多的KLE细胞进入S期；下调EMX2表达对KLE细胞的凋亡无明显影响。(3)裸鼠成瘤实验中，EMX2过表达可明显抑制RL95-2移植瘤的生长速度(P=0.005)和肿瘤重量(P=0.023)。结论：体内外实验证明EMX2可抑制子宫内膜癌的增殖、迁移、侵袭等恶性行为。第四部分Wnt信号通路介导EMX2基因的抑癌作用目的：探讨EMX2基因通过Wnt信号通路发挥其抑癌作用的分子机制。方法：用pcDNA3.1-EMX2上调RL95-2和siRNA-EMX2下调KLE细胞中EMX2表达后，用realtime PCR和western blot检测细胞内Wnt信号分子β-catenin及其靶基因cyclin D1的表达改变。分别用Wnt信号通路抑制剂XAV-939和激动剂LiCl预处理子宫内膜癌细胞后，再次用pcDNA3.1-EMX2上调RL95-2和siRNA-EMX2下调KLE细胞中EMX2表达，观察EMX2表达改变对细胞增殖、周期的影响。结果：(1)上调EMX2可抑制RL95-2细胞中β-catenin及其下游因子cyclin D1的表达；反之，下调EMX2后KLE细胞中β-catenin、cyclin D1表达上升。(2) EMX2过表达对β-catenin/cyclin D1的抑制作用可被LiCl拮抗,同时EMX2对RL95-2细胞的增殖、周期抑制被解除；EMX2失活对β-catenin/cyclin D1的激活作用可被XAV-939明显削弱,同时EMX2失活对KLE细胞的促增殖、周期作用被XAV-939消除。结论：Wnt信号作为关键通路介导了EMX2基因在子宫内膜癌中发挥抑癌作用。