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目的本课题拟通过研究miR-200b在糖尿病血管内皮氧化应激损伤及自噬发生过程中的改变,并利用生物信息学软件预测miR-200b可能参与调控mTOR信号通路,以此探讨miR-200b调控氧化应激损伤及自噬发生的分子机制,为糖尿病血管病变寻找新的治疗靶点。方法1.分别选用10周龄db/db雄鼠25只作为糖尿病模型组,10周龄的野生雄鼠25只作为空白组。在两组小鼠的鼠龄达到第10周龄时,连续五周监测小鼠的体重及血糖,对于模型组小鼠随机血糖<16.7mmol/L予以剔除。于小鼠14周龄获取小鼠血清使用Elisa法检测血清AGEs、SOD及MDA的含量,使用苏木素-伊红对小鼠胸主动脉进行染色,观察血管形态结构改变;RT-qPCR测定血管中miR-200b含量,同时使用Western-blot定量主动脉血管内mTOR及自噬蛋白LC3-II、p62的表达。2.运用AGEs处理Eahy内皮细胞构建糖尿病血管病理性改变的细胞模型,分别使用不同浓度(0、50、100、200、400μg/L)的AGEs干预3h、6h、12h、24h,通过检测不同条件下细胞药物敏感增殖性及细胞ROS、SOD及MDA等氧化应激水平,获得AGEs干预的最佳剂量及最佳时间。在上述研究的基础上,将实验分成空白组、AGEs组、AGEs+PBS组、AGEs+miR-200b抑制剂组、AGEs+ROS抑制剂组,使用相应试剂干预48h后,利用流式细胞技术及Elisa法检测血管内皮ROS、SOD及MDA的含量,RT-qPCR检测各组血管内皮miR-200b的相对表达量,Western-blot检测内皮细胞mTOR及自噬蛋白LC3-II、p62的表达。结果1.糖尿病模型组与空白组对比,小鼠的体重及血糖水平显著增高(P<0.001);HE染色显示模型组小鼠胸主动脉血管局部呈动脉粥样硬化性改变,血管平滑肌显著增生、排列紊乱,部分内皮细胞脱落,而空白组小鼠血管未发现明显病理性改变;与空白组相比,糖尿病模型组小鼠血清中AGEs和MDA的含量显著增高,而SOD的含量明显降低;目标基因miR-200b及自噬蛋白LC3-II的表达在糖尿病模型组小鼠主动脉血管内高于空白组,而mTOR的表达则低于空白组,上述差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.根据细胞药物敏感性增殖结果及ROS、SOD及MDA等氧化应激水平的改变,确定AGEs干预浓度为200μg/L,干预时间为6h可获得最佳实验效应;氧化应激指标的检测结果证实,与空白组相比,AGEs组内皮细胞中ROS、MDA的水平显著增高,而SOD的含量则下降;相对于AGEs+PBS组,AGEs组的三个指标的表达无统计学差异(P>0.05),而miR-200b抑制剂组和ROS抑制剂组内皮细胞内ROS、MDA的水平下降,SOD的水平显著升高;RT-qPCR的检测结果显示,使用AGEs处理后,Eahy内皮细胞miR-200b的表达明显高于空白组,但与AGEs+PBS组的表达无统计学差异(P>0.05),而miR-200b抑制剂组及ROS抑制剂组miR-200b的产生则明显低于AGEs+PBS组;Western-blot测定结果显示,与空白组相比,AGEs干预后血管内皮细胞内mTOR的表达降低,自噬蛋白LC3-II及p62的表达升高;但AGEs组与AGEs+PBS组相比,蛋白检测指标的表达均无统计学差异(P>0.05);与AGEs+PBS组对比,AGEs+miR抑制剂组和ROS抑制剂组mTOR的表达均增高,LC3-II及p62的表达均减低,上述差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.miR-200b在2型糖尿病血管内皮细胞氧化应激损伤和自噬的发生过程中表达上调;2.AGEs诱发的血管内皮氧化应激反应可促进Eahy内皮细胞自噬的发生;3.miR-200b通过抑制mTOR的表达参与AGEs诱导血管内皮自噬的调控。