论文部分内容阅读
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患传染病,病死率近100％。自建国以来我国已有120000余人死于该病,狂犬病已成为危害我国公共卫生安全的重要疫病。对于该病尚无有效的方法进行暴露后治疗,疫苗免疫接种是唯一有效的防治措施。灭活疫苗虽然安全,但制作成本高昂,在保存和接种副反应等方面存在不足,减毒活疫苗虽然免疫效果优良,但存在病毒返祖、潜在感染等风险,因此,有必要加强安全、高效、廉价的新型基因工程狂犬病疫苗的研究。
本研究首先应用RT-PCR方法以弱毒疫苗株。HEP-Flury病毒基因组为模板克隆鉴定了狂犬病病毒主要保护性抗原糖蛋白基因,并以之为靶基因,构建了含有单个拷贝糖蛋白基因的重组腺病毒穿梭载体’pShulttle-RVG-IKES-hrGFP-1。然后,以口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列为糖蛋白基因之间的介导序列,分别构建了含有两个和三个拷贝糖蛋白基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dRVG-IRES-hrGFP-1和pShuttle-tRVG-IRES-hrGFP-1。将以上构建的重组穿梭载体分别转染AD-293细胞,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,斑点印记实验证实了重组穿梭载体中糖蛋白表达盒正确有效。接着将三个重组穿梭载体线性化后分别转化入含有人5型复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态菌株BJ5183-1中进行同源重组,PCR、Pac Ⅰ单酶切和测序结果证实获得了重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒线性化回收后脂质体法转染AD-293细胞,在第六天时普通显微镜下观察到明显的细胞病变效应,荧光显微镜下观察到IRES介导的绿色荧光蛋白的表达,收获病毒液负染后电镜下看到典型的腺病毒粒子形态,其基因组经PCR扩增,证实获得了含有狂犬病病毒单、双及三个拷贝糖蛋白基因的三株重组腺病毒AdHu5-RVG-hrGFP、AdHu5-dRVG-hrGFP和AdHu5-tRVG-hrGFP。
之后,对重组腺病毒的增殖能力、抗原表达特性及遗传稳定性进行了研究。病毒增长曲线表明,在腺病毒基因组中插入单、双或三个拷贝糖蛋白基因对病毒的复制增殖没有明显的影响,Western blot结果证实口蹄疫病毒2A自剪切多肽有效介导了糖蛋白的独立表达且对其免疫学功能没有产生影响。激光共聚焦显微技术对表达的糖蛋白亚细胞定位研究发现,口蹄疫病毒2A自剪切多肽融合在糖蛋白的末端并没有干扰细胞对其正常的加工递呈,主要富集在细胞膜上。流式细胞仪检测结果显示,重组腺病毒AdHu5-dRVG-hrGFP和AdHu5-tRVG-hrGFP对糖蛋白的表达能力高于AdHu5-RVG-hrGFP。Southern blot和PCR鉴定结果显示,重组腺病毒经过连续传16代后,没有发生糖蛋白基因的缺失和突变,具有良好的遗传稳定性。最后,以BacL/C小鼠为实验动物,对三株重组腺病毒的免疫原性进行了分析。无论是口服免疫还是肌肉免疫三株重组腺病毒均一定程度上诱导了小鼠体内抗RVG特异性抗体的产生,通过统计学分析,表达多个拷贝糖蛋白基因的重组腺病毒AdHu5-tRVG-hrGFP或AdHu5-dRVG-hrGFP所诱导的小鼠抗体水平与表达单个拷贝糖蛋白基因的重组腺病毒所诱导的抗体水平相比获得了明显改善。