稀有人参皂苷是人参皂苷中的重要活性成分,主要为人参皂苷Rg3、Rg2、 Rh1、Rh2等,在原药材中含量低或者不存在,可经炮制或代谢转化生成,具有广泛的药理作用。以抗肿瘤作用最具临床价值,其中人参皂苷Rh2及Rg3等已经被当作抗肿瘤药物开发。另外,人参皂苷Rg2具有增强心功能、改善血液流变学变化、保护心血管及保护脑神经元的作用。人参皂苷Rh1具有免疫调节、抗肿瘤、改善小鼠记忆力及改善糖皮质激素抵抗等作用。但由于稀有人参皂苷在原药材中的含量极少,分离纯化的成本高,而且工艺复杂。目前检测的常用方法有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)等,但是由于这些方法的样品前处理过程复杂、所需仪器昂贵、检测成本高等原因,不能够灵敏简便快速的测定及分离,限制了对稀有人参皂苷的深入研究。基于中药小分子单克隆抗体(Mab)的免疫学分析方法(IA)是近年来新兴的检测技术,具有灵敏度高、特异性强的特点,对于中医药的现代化研究,包括中药质量控制、中药鉴定、中药有效成分的分离纯化、中药复方体内代谢过程及药理药效研究等,与常规理化分析技术相比,具有特有的优势。本实验从人参皂苷Rh1人工抗原的合成开始,通过小鼠免疫,细胞融合技术获得了抗人参皂苷Rh1特异性单克隆抗体。以此为基础建立了人参皂苷Rg2特异性的间接竞争ELISA法,并应用该法进行中药复方及人体唾液中人参皂苷Rg2含量检测。并尝试对基于所获得抗体的免疫亲和层析柱(IAC)的建立及其敲除法进行研究。本研究所进行的主要内容和获得的主要结果如下：1.根据人参皂苷Rh1的分子结构特征,以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白,用高碘酸钠氧化法合成人参皂苷Rh1人工抗原(免疫抗原(GsRhl-BSA)和包被抗原(GsRhl-OVA))。分别通过紫外扫描法与薄层色谱法检测,均鉴定偶联成功。2.用免疫原GsRhl-BSA免疫BALB/c小鼠,四次免疫后断尾取血,建立小鼠抗血清间接ELISA法的最佳工作条件,采用棋盘法测得最佳包被浓度为1：4000,采用10mg/mL的明胶溶液封闭,利用间接ELISA法对抗血清的效价及特异性进行测定。3.选取效价较高而且能与人参皂苷Rh1特异性反应的4号小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在PEG介导下融合。利用有限稀释法筛选出特异性分泌抗人参皂苷Rh1单克隆抗体(anti-GRhl Mab)的杂交瘤细胞系,选择细胞培养液上清中抗体效价及特异性都较好的1G8C8株,采用腹水法大量制备单抗。4.采用辛酸／硫酸铵法纯化腹水。以间接ELISA法和间接竞争ELISA法对抗体进行鉴定。结果显示：(1)腹水的抗体效价高达1：2048000,单克隆抗体对人参皂苷Rh1灵敏度为125ng/mL,线性范围26～512ng/mL,而对人参皂苷Rg2的灵敏度更高,为28ng/mL,因此将其称作人参皂苷Rg2的单克隆抗体更为恰当。(2)与该抗体有特异性反应的有人参皂苷Rg2(470.65%)、人参皂苷Rh1(100%)、人参皂苷Rg3(13.88%)、人参皂苷Rh2(12.25%)、人参皂苷Rf(10.80%),根据五种人参皂苷的化学结构研究发现,在C-20位置上都有一个S型羟基。而对存在R型羟基的人参皂苷没有交叉反应,这可以提示该单克隆抗体(1G8C8)识别抗原决定簇的位置。5.以获得的抗人参皂苷Rg2单克隆抗体为基础,选择一抗最佳工作浓度1：10000,建立人参皂苷Rg2间接竞争ELISA检测法,该方法线性范围为4～128ng/mL,最低组内和组间差异均不超过7.06%,回收率平均为101.65%,说明该方法准确性好、稳定可靠。并用该方法成功测定14种含有人参的常用方剂中的人参皂苷Rg2的含量。尝试测定人口服人参颗粒后唾液中人参皂苷Rg2的含量,分析其代谢情况。6.以获得的抗人参皂苷Rg2单克隆抗体为基础,研究制备人参皂苷Rg2免疫亲和层析柱。对人参皂苷Rg2敲除法的建立进行了探索。实验结果表明,已成功制备出高效价、高灵敏度的人参皂苷Rg2单克隆抗体,并在此基础上建立了人参皂苷Rg2酶联免疫吸附分析(ELISA)法。由于该法在检测上具有独到优势,即检测灵敏度高(可达ng/mL级别)、样品前处理简单(样品稀释后直接可用)以及对检测样品量要求低(只需50ul/孔),不需要复杂昂贵的仪器设备等特点,该法在对中药材的质量检测、中药复方有效物质基础的研究等方面具有很好的应用前景。