研究背景:加速创面愈合是千百年来医学实践者一直努力追求的目标,随着代谢性疾病和人口老年化的问题日益严重,难愈性创面已成为一个长期的医学难题,其发病率和伴随的医疗成本投入逐年增加。尽管对于如何促进难愈性创面的生修复进行了大量研究,目前难愈性创面的临床治疗效果仍然欠佳,因此,解决难愈性创面愈合过程中的关键问题以及开发促进创面愈合的新策略具有重要的临床意义。血管损伤或血管生成不足是糖尿病、周围血管病等引发的大部分难愈性创面的病理基础。大血管病变与微血管病变使得创面血流供应不足,无法为创面修复过程供应足够的氧气与营养物质,导致正常炎症反应受损和感染几率增加。因此,增强创面血管再生能力是促进难愈性创面愈合的重要目标。目前的策略集中在设计生物材料来传递外源性促血管再生因子,但其临床转化后的收益十分有限。其中很重要的原因是,难愈性创面往往表现为持续的慢性炎症、高度蛋白水解、过度氧化应激的恶劣再生环境,在这种环境中除了损害了本身组织再生进程且外源性的促血管再生因子的生物利用度被严重限制。免疫细胞是创面愈合微环境的核心组成部分,其中巨噬细胞主导着创面修复的免疫反应。巨噬细胞通过对微环境信号的响应,产生一系列多样和动态连续的生物学活动,从具有促炎特性的经典激活M1表型转化到具有抗炎和组织修复功能的替代激活M2表型,协调着创面愈合的进程。而在难愈性创面中,由于各种病理因素的存在,表现为M1型巨噬细胞的累积和向M2型巨噬细胞转化障碍,过度激活了与M1型巨噬细胞相关的促炎、蛋白水解、诱导凋亡等功能,从而形成了难愈性创面恶劣的再生环境。因此,在刺激血管生成的同时,调节巨噬细胞的表型转化而改善创面再生环境,有希望从根本上促进创面血管再生。本课题中,我们设计制备了一种负载活性工程益生菌的多功能水凝胶（HP@LL＿VEGF）,局部应用于创面后,通过原位生产投递血管内皮生长因子（VEGF）与巨噬细胞表型调控分子（乳酸）,持续提供刺激血管再生信号和调控创面局部免疫反应,重塑创面愈合微环境,促进创面快速血管化,从而加速难愈性创面修复过程。本课题融合了合成生物学与生物材料学原理,从创面愈合微环境出发,为未来开发基于工程益生菌活体材料平台用于难愈性创面的治疗提供了详实的实验基础与新的思路。目的:本研究拟联合通过合成生物学工程改造的乳酸乳球菌与经过肝素修饰的泊洛沙姆共聚物共同制备负载活性工程益生菌的多功能水凝胶（HP@LL＿VEGF）,探究其局部用于难愈性创面时对促进血管再生和创面修复的作用,为治疗难愈性创面的新型功能材料的开发提供了新的方向。方法:1乳酸乳球菌的工程化改造及其生物学表征研究1.1乳酸乳球菌的工程设计与改造:以益生菌乳酸乳球菌为底盘生物,将编码信号肽（Usp45）、生物效应蛋白（Vegf）、诱导剂耐受因子（nsr）等功能基因元件组装工程质粒,电击转化乳酸乳球菌,构建能够在食品级抗菌肽Nisin诱导下分泌VEGF的工程益生菌（LL＿VEGF）。1.2 LL＿VEGF分泌VEGF蛋白与乳酸的生物学表征研究:通过拟合在不同浓度Nisin下的生长曲线,确定最佳诱导浓度;通过Western blot、ELISA测定LL＿VEGF分泌VEGF的能力;通过基于温敏质粒与同源重组双交换的方法敲除乳酸脱氢酶,通过p H、乳酸浓度测定探究LL＿VEGF通过乳酸脱氢酶产乳酸能力。2 HP@LL＿VEGF的制备与材料学表征研究2.1 HP共聚物的合成与材料学表征:以末端氨化的泊洛沙姆聚合物为骨架,通过EDC/NHS法将肝素通过缩合反应修饰到泊洛沙姆上制备HP共聚物;利用核磁共振波谱仪、傅里叶红外光谱仪表征共聚物结构与化学键的形成。2.2 HP@LL＿VEGF的制备与材料学表征:通过低温混合方法将LL＿VEGF负载到HP水凝胶中,通过流变仪表征HP@LL＿VEGF的温敏性能;通过扫描电子显微镜、酶标仪和共聚焦激光扫描显微镜分析工程益生菌在水凝胶的生长与分布;利用ELISA与乳酸浓度测定试剂盒表征HP@LL＿VEGF动态产生和分泌VEGF和乳酸的过程。3 HP@LL＿VEGF的促进血管再生与调控巨噬细胞表型作用研究3.1 HP@LL＿VEGF体外促进血管再生的作用:通过CCK-8增殖活性实验、对Ki67免疫荧光染色、划痕实验、血管成管实验,评价HP@LL＿VEGF体外促进HUVECs增殖、迁移和血管结构形成的功能。3.2 HP@LL＿VEGF促进巨噬细胞从M1型向M2型转化的作用:通过流式细胞术、免疫荧光染色、RT-q PCR、Western blot实验,探究HP@LL＿VEGF处理后,M1型极化的BMDMs中M2型巨噬细胞的比例变化与M2型相关标志物的表达情况。4 HP@LL＿VEGF促进创面修复的作用研究4.1建立小鼠糖尿病创面模型:采用STZ联合高糖高脂饲料的方法诱导建立糖尿病小鼠模型;利用皮肤打孔器制作全层皮肤缺损模型。4.2局部原位使用HP@LL＿VEGF的生物安全性评价:利用激光散斑血流成像仪评价HP@LL＿VEGF使用后炎症诱发的局部充血情况;通过RT-q PCR检测炎症相关基因的表达情况,评价HP@LL＿VEGF使用后创面局部炎症反应;通过对外周血炎症细胞计数,评价HP@LL＿VEGF使用后小鼠系统性炎症情况;通过测定血清乳酸浓度,评价HP@LL＿VEGF对小鼠系统性酸碱平衡的影响。4.3工程益生菌在创面局部的驻留与分布:以HP@LL＿m Cheery为报告载体,通过小动物活体成像系统采集不同时间点创面的荧光图片,分析工程益生菌在创面的生长与活性维持;通过采集不同时间点的创面组织冰冻切片,观察工程益生菌在创面的分布情况。4.4 HP@LL＿VEGF促进糖尿病创面愈合的作用研究:将HP@LL＿VEGF用于糖尿病创面后,通过连续采集和统计创面变化情况,评价HP@LL＿VEGF促进糖尿病创面愈合的情况;通过对创面组织切片的H&E染色和Masson染色,评价HP@LL＿VEGF促进肉芽组织再生与胶原再生的作用;通过激光散斑血流成像和CD31免疫荧光染色,评价HP@LL＿VEGF促进血管再生作用;通过对M1、M2型巨噬细胞标志物i NOS、CD206、Arg1的免疫荧光染色,评价HP@LL＿VEGF减少创面组织中M1型巨噬细胞浸润,增加M2型巨噬细胞比例的作用。5 HP@LL＿VEGF促进创面愈合的机制研究5.1转录组测序与差异表达基因的筛选:通过Illumina公司Hi Seq X平台,对HP@LL＿VEGF处理与对照组的创面组织分别进行转录组测序,以小鼠参考基因组为映射,筛选两组的差异表达基因。5.2差异表达基因的富集分析:通过Gene Ontology数据库对筛选到的差异表达基因的分子功能、细胞组分和参与的生物过程进行功能注释和富集分析;利用KEGG数据库对筛选到的差异表达基因进行信号通路的富集分析;利用STRING算法挖掘蛋白质-蛋白质相互作用的信息。结果:1乳酸乳球菌的工程化改造及其生物学表征研究1.1 Nisin可诱导增强LL＿VEGF分泌VEGF蛋白的能力,且10μg/m L的浓度对LL＿VEGF生长没有影响,但可以显著抑制野生型LL与金黄色葡萄球菌的生长,形成了一个相对抑菌的环境;1.2在LL＿VEGF培养上清中可检测到蛋白结构正确的VEGF蛋白,VEGF的动态分泌与Nisin浓度呈正相关,LL＿VEGF在Nisin诱导3 h后VEGF产量最大化（每109个细胞约6 ng）,但由于其半衰期较短,在24 h内逐渐下降;1.3培养12 h后野生株与工程株培养上清液中乳酸浓度约60 mmol/L,而乳酸脱氢酶敲除株约12 mmol/L。2 HP@LL＿VEGF的制备与材料学表征研究2.1核磁共振氢谱结果表明HP共聚物中出现肝素（H）与泊洛沙姆（P）的特征性化学位移;2.2傅里叶红外光谱结果提示HP共聚物中形成特征性酰胺键结构;2.3 HP@LL＿VEGF具有典型的逆向温敏性能,在制备与保存时保持溶胶状态,应用于皮肤创面后快速形成凝胶覆盖创面,成胶温度为25～30℃,成胶后模量为≈9 k Pa;2.4 HP水凝胶能够维持工程益生菌较高的生长与质粒表达活性,工程益生菌限制在水凝胶内且呈空间均匀分布,随时间的延长,细菌数量逐渐增加;2.5 HP@LL＿VEGF 24 h内能够持续产生并释放VEGF蛋白,肝素的修饰减少了VEGF的自身降解;2.6 HP@LL＿VEGF能够24 h内能够持续产生并释放乳酸分子。3 HP@LL＿VEGF的促进血管再生与调控巨噬细胞表型作用研究3.1增殖实验表明,HP@LL＿VEGF在体外能够促进HUVECs增殖,增加Ki67阳性细胞比例;3.2划痕试验结果显示,HP@LL＿VEGF在体外提高了HUVECs的迁移速率,促进了无细胞间隙的闭合;3.3成管实验提示,HP@LL＿VEGF在体外提高了血管内皮细胞的形成血管结构的能力;3.4流式细胞术定量结果表明,HP@LL＿VEGF在体外增加M1型BMDMs中M2型巨噬细胞的比例,且该作用来源于乳酸;3.5免疫荧光染色结果表明,HP@LL＿VEGF能够诱导了与M2样巨噬细胞表型相关位于细胞膜的CD206和细胞质中ARG1的表达,抑制M1型巨噬细胞相关CD86的表达;3.6 HP@LL＿VEGF通过产生乳酸,降低炎症介质和蛋白酶等（Tnf-α、inos、Mmp9）的表达,促进内源性生长因子等促修复信号因子（Il-10、Arg1、Cd206、Vegf）的表达。4 HP@LL＿VEGF促进创面修复的作用研究4.1局部应用HP@LL和HP@LL＿VEGF功能水凝胶后,创面周围炎症诱导的充血状态有所下降,炎症相关基因Il-1β、Nf-κb、Nos2、Tnf-α的表达均无明显升高;4.2使用HP@LL＿VEGF后小鼠外周血白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）与单核细胞数量（MON）与创面对照组相比无明显变化;4.3正常皮肤组、创面对照组、HP@LL组与HP@LL＿VEGF组糖尿病小鼠血清乳酸浓度均保持在正常范围内且各组间无明显差异;4.4联合水凝胶使用后,工程菌被限制在创面局部,荧光强度在12 h达到高峰,且24 h内维持在较高强度,从冰冻切片结果观察到工程菌被限制在创面表面,工程菌的生长与分布相对集中于水凝胶内部;4.5使用HP@LL＿VEGF处理的小鼠创面愈合速度明显加快,第6天愈合率接近50%。第12天,HP@LL＿VEGF组创面愈合率约为90%,对照组和HP组创面愈合率约为30-50%,HP@LL和HP@rm VEGF组创面愈合率约为70-80%;4.6相比于其他组,HP@LL＿VEGF组创面肉芽组织更厚,胶原沉积比例更高;4.7 HP@LL和HP@LL＿VEGF组小鼠i NOS+M1巨噬细胞比例明显降低,CD206+和Arg1+M2巨噬细胞浸润增加;4.8 HP@LL＿VEGF治疗组创面血流灌注明显增加且CD31阳性面积比例更高。5 HP@LL＿VEGF促进创面愈合的机制研究5.1使用HP@LL＿VEGF后共鉴定出3080个差异表达基因,其中上调基因1026个,下调基因2054个;5.2经过分层聚类分析分离筛选,HP@LL＿VEGF治疗后,与血管生成和创面愈合相关的Vegfa、Fgf1、Vegfb,Egf、Notch4等基因显著上调表达,而与炎症相关的基因如Tnf、Ccl2、Il-18、Il-1r1、Myd88,与蛋白质水解相关的基因如Mmp2,Mmp9和Mmp3以及和细胞凋亡相关的基因如Casp1、Casp3,显著下调表达;5.3 KEGG富集分析结果提示,上调基因集的功能主要富集在与正向调控血管再生、创面愈合、能量代谢的细胞通路上,下调基因集的功能主要富集在降低创面炎症细胞浸润、细胞凋亡、高血糖损伤、以及蛋白水解相关等信号通路;5.4 GO富集分析结果提示,上调基因集的功能主要富集在氧化还原过程、对含氧物质细胞响应、细胞稳态、组织形成、血流循环调控、对生长因子的细胞响应、血管形成等,下调基因集的功能主要富集在蛋白水解过程的正向调节、凋亡通路、TNF的细胞响应、白细胞迁移、炎症反应中淋巴细胞激活、IL-6的正向激活、慢性炎症反应等;5.5蛋白互作网络分析结果中,上调基因集中VEGF控制的核心网络作用参与促进血管再生与创面修复的作用,下调基因集中则是TNF主导的蛋白作用网络参与改善糖尿病创面形成的病理环境。结论:本课题提出了一种新的活体工程益生菌水凝胶材料治疗难愈性创面的策略,我们成功设计并制备了负载活性工程益生菌的多功能水凝胶（HP@LL＿VEGF）。该功能材料通过将能够分泌VEGF和乳酸的工程细菌固化包裹在支持细菌生长的水凝胶内部,通过原位持续生产并投递VEGF和乳酸,刺激血管内皮的增殖、迁移、成管等生命活动,同时调控M1型巨噬细胞向M2型的转化,重塑了创面局部免疫反应,两者共同促进形成了利于血管与组织再生的创面愈合微环境,从而推动了血管网络功能重建的进程,进一步促进了难愈性创面的快速修复。