论文部分内容阅读
猪嗜血支原体(Mycoplasma suis, M. suis)是猪附红细胞体病(Porcine Eperythrozoonosis, PE)的病原体,该病原是一类无细胞壁、嗜血液寄生的多形态微生物,临床上可以引起猪的热性、溶血性、散发性传染病,并以高热、贫血、黄疸等为主要特征,一般呈不显性感染,多在应激因素作用下发病。猪嗜血支原体病在全球分布广泛,给养猪业带来了严重的经济损失。目前,M.suis还不能在体外培养,而且对该病原感染红细胞的致病机制还不清楚。MSG1蛋白是猪嗜血支原体的一种重要的表面黏附蛋白,M.suis通过其表面黏附蛋白和红细胞的吸附是发挥致病作用的第一步,因此,探索与MSG1蛋白相互作用的红细胞膜蛋白具有非常重要的意义。本研究具体内容如下：1.猪嗜血支原体表面黏附蛋白MSG1相关红细胞膜蛋白的筛选与鉴定首先提取健康猪红细胞膜蛋白,然后应用原核表达的M. suis重组MSG1蛋白(His-tag)采用亲和层析方法,将重组MSG1蛋白和猪红细胞膜蛋白依次结合到Ni-NTA亲和层析柱上,通过洗涤杂蛋白后,最后洗脱与重组MSG1蛋白结合的红细胞膜蛋白。SDS-PAGE电泳后对捕获的三条蛋白条带切胶进行质谱分析,质谱分析结果显示这三种红细胞膜蛋白分别是猪乳转铁蛋白(Lactotransfferrin, LTF),肌动蛋白(p-actin)和带3蛋白(Band3).2.红细胞膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定通过基因合成方法合成了LTF全基因(2115bp),以此合成基因为模板扩增出LTF全基因N端762bp碱基(LTF-N762).将PCR扩增出的基因片段连接到pET-32a(+)原核表达载体中,构建了重组质粒pET-32a-LTF-N762.用IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE结果显示两个重组表达菌株均表达了高水平的重组蛋白32a-LTF-N762-以原核表达纯化的重组蛋白采用背部多点皮下注射方法分别免疫小鼠和家兔,间隔两周免疫一次,第三次免疫后通过间接ELASA方法测定抗血清效价,32a-LTF-N762蛋白小鼠和家兔的抗血清效价分别为1：102400、1：51200。Western blot结果证明这两种抗血清均能与重组蛋白发生特异性反应。用KLH偶联的小肽(band3:CGPEDPHIDYNQLGR)制备band3兔多克隆抗体,免疫和检测方法同上,间接ELASA结果显示抗体效价达到1：512000；β-actin抗体来自商品化兔多抗。用LTF、Band3和β-actin三种兔多抗分别鉴定健康猪红细胞膜蛋白,Western blot实验结果显示这三种抗体均能与红细胞膜蛋白发生特异性反应；间接免疫荧光实验(IFA)结果显示红细胞边缘均出现特异性绿色荧光,证明了本研究通过亲和层析法筛选的红细胞膜蛋白均存在红细胞膜上。3.猪嗜血支原体MSG1蛋白与红细胞膜蛋白相互作用的分析用纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和已制备的MSG1单克隆抗体(1A7)在红细胞和哺乳动物细胞上分别进行间接免疫荧光实验,结果证明重组MSG1蛋白能够与红细胞和哺乳动物细胞发生特异性吸附。激光共聚焦实验结果证明MSG1蛋白能分别与LTF、Band3和β-actin三种蛋白共定位在红细胞膜上。此外,本研究设计并合成β-actin siRNA片段,在哺乳动物细胞水平进行siRNA干扰,实验结果证明了MSGl蛋白与β-actin的特异性相互作用。综上所述,本研究筛选了与猪嗜血支原体表面黏附蛋白MSG1相关的三种猪红细胞膜蛋白,并制备了LTF和Band3蛋白兔多克隆抗体,进一步分析了MSG1蛋白与LTF、band3和β-actin三种蛋白的相互作用,为研究猪嗜血支原体感染红细胞的致病机制奠定了基础。