目的:随着癌症诊断治疗相关研究的深入,肿瘤酶在肿瘤发生发展与治疗诊断中的地位愈发重要。肿瘤酶具有特异性表达于肿瘤组织的普遍特征,如基质金属蛋白酶2在多种肿瘤的表达量中较正常组织大大增加,这对诊断肿瘤的病理分期和新生血管的生成等都具有指导意义,又例如肿瘤酶Legumain,它高表达于乳腺癌、结肠癌及前列腺癌等肿瘤组织新生血管内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞以及瘤细胞中等。因此肿瘤酶是肿瘤形成过程中的重要标志分子,基于分子影像技术对肿瘤酶进行检测及成像,对研究肿瘤酶在肿瘤进程的作用及分子机制、早期诊断等都有十分重要的意义。方法:1、研究中首先合成基于荧光能量共振转移系统肿瘤酶MMP2激活型量子点前体纳米探针。主要方法有:第一、采用水相合成法制备水溶性量子点(QD-MPA),通过配体交换反应修饰巯基化低分子量肝素制得QD-LMWH,分别采用红外光谱法、紫外分光光度计法、荧光分光光度计法、Ellman’s试剂测定巯基含量法、班氏试剂检识法、琼脂糖凝胶电泳法、热重分析法以及透射电镜验证并优化了 QD-LMWH的制备。第二、利用化学偶联方式合成ALMWP-QSY,并通过高效液相色谱法和质谱法进行分离验证。第三、以自组装方式合成量子点前体纳米探针,经荧光分光光度计法、鱼精蛋白激活测试、粒径、ζ电位以及透射电镜的方法进行表征,考察并确定自组装最佳比例及其荧光稳定性。2、本研究进一步研究了 MMP2激活型量子点前体探针的体内外活性,对此探针在非肿瘤细胞293T以及肿瘤细胞HT1080、MCF7、B16、Hela、SW620内的摄取激活行为进行了定性及定量的测定,并通过蛋白印迹方法验证。3、本研究中采用HT1080、SW620以及MCF7三种小鼠肿瘤模型对此量子点前体纳米探针的活体诊断效果进一步考察,通过局部注射以及全身注射多种给药方式进行验证。4、本研究还在细胞水平和动物水平分别对此量子点前体纳米探针的生物安全性进行了评估。5、研究中还针对此前体纳米诊断系统的应用适配性设计合成并表征了基于荧光能量共振转移系统的肿瘤酶Legumain激活型量子点前体探针,并对其进行了表征及体内外实验。结果:1、本研究中成功制得了粒径约200 nm的纳米探针,形态均一且分散性良好。在生理缓冲液里QD-LMWH和MMP2激活型量子点前体纳米探针荧光稳定性良好。这是一种基于荧光能量共振转移系统的肿瘤酶激活型量子点前体纳米探针系统,此系统在正常组织内处于淬灭状态,在肿瘤组织可激发出荧光。此纳米探针系统由两部分组成,一部分是低分子量肝素修饰的量子点(QD-LMWH);另一部分是偶联荧光淬灭剂的嵌合型多肽(肿瘤酶底物肽-低分子量鱼精蛋白,ALMWP-QSY)。由于低分子量肝素/低分子量鱼精蛋白两部分之间强烈的亲和及静电吸引作用,从而通过自组装形成荧光能量共振转移系统,当前体探针进入肿瘤部位,肿瘤酶底物肽被肿瘤酶切断后,荧光淬灭剂会从量子点表面脱落,令其荧光得以恢复。2、此探针在HT1080细胞中高度激活,在其他肿瘤细胞中轻度激活,而在非肿瘤系293T细胞中几乎无激活行为。Western Blot结果证明了其探针激活能力与细胞内外MMP2表达总量正相关。3、在生理缓冲液里该量子点前体纳米探针具有较强的酶切特异性,而非特异性胰酶的酶切效果不明显。4、经尾静脉注射后探针在肿瘤部位聚集并激活,尤其2 h至4 h肿瘤部位荧光值是非肿瘤部位的2倍以上,具有很好的区分效果。6 h后探针逐渐消除。24 h后取出主要脏器进行体外成像,显现肿瘤组织具有最高的荧光强度。经肌肉注射后局部注射部位无明显激活荧光出现,表明了此探针的非特异性酶切作用不明显。5、细胞毒性、动物体重变化、存活率、脏器系数统计以及病理组织切片结果共同证明相比未修饰的量子点,QD-LMWH的毒性降低,量子点前体纳米探针系统的毒性降低更明显,其生物应用安全性大大提高。6、经更换肿瘤酶底物肽重新构建了肿瘤酶Legumain激活型量子点前体探针,经体内外诊断检测效果及安全性评价数据显示,此探针粒径均一、分散性良好、发光性能优异,同样具备相应肿瘤酶响应特异性较强,专属性良好以及毒性低的特点。结论:根据肿瘤酶的特点设计前体诊断探针实现活体水平诊断筛查肿瘤已渐成焦点的现状,本研究中成功制备了肿瘤酶MMP2激活的量子点前体纳米探针,其在体内外均具备良好的肿瘤成像诊断检测效果及较高的生物安全性。同时本研究证明了此量子点前体纳米探针系统具有一定的适配性,通过更换底物肽的方式可获得不同肿瘤酶激活型的前体纳米探针,这是一种极具发展潜力的肿瘤诊断检测方法。