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[目的]肝细胞肝癌是原发性肝癌中最多见的恶性肿瘤,死亡率仅次于胃癌、食道癌。HBV的感染与肝细胞肝癌的发生密切相关。MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物中广泛存在的,内源性的大小约21—23个碱基的单链小分子RNA。近年来的研究表明,miRNA和人的包括癌症在内的多种疾病的发生紧密相关。以往的研究表明,在HBV相关的肝细胞肝癌中,miRNA的表达谱发生了显著的变化。但是,HBV调控miRNA表达变化的机制目前尚不清楚。在本课题中,我们通过深度测序,发现了在HBV阴性肝癌组织和HBV 阳性肝癌组织中差异表达的miRNA:C19MC基因簇和miR-1269b。本项研究的目的是研究HBV感染导致C19MC基因簇和miR-1269b异常表达的分子机制。[方法]首先,通过深度测序检测在HBV阴性和HBV阳性肝癌组织中差异表达的miRNA,并选取了我们感兴趣的miRNA:C19MC基因簇和miR-1269b作为进一步研究目标。通过qRT-PCR方法,在肝细胞肝癌组织和细胞中,验证C19MC基因簇和miR-1269b的差异表达以及HBx蛋白调控其表达。接下来,综合文献和生物信息学预测C19MC基因簇上游甲基化岛,qRT-PCR检测去甲基化后C19MC基因簇的表达。同时qRT-PCR检测HBx蛋白对DNMT3A和DNMT1表达的影响。此外,我们利用qRT-PCR检测,HBV和HBx蛋白对miR-1269b初始转录本的影响并利用生物信息学网站预测构建miR-1269b的启动子。在293T细胞和HepG2细胞中,通过双荧光素酶报告系统验证miR-1269b启动子的活性以及HBV和HBx蛋白对miR-1269b启动子的作用。进一步预测miR-1269b启动子可以结合的转录因子,双荧光素酶报告系统检测HBx蛋白调控的转录因子NF-κB对miR-1269b启动子的作用。通过构建NF-κB结合位点缺失的miR-1269b启动子,双荧光素酶报告系统确定NF-κB是否直接结合miR-1269b启动子。同时通过qRT-PCR检测NF-κB对miR-1269b表达的影响。[结果]qRT-PCR结果证实HBV可以下调C19MC基因簇和miR-1269b的表达。在此基础上,转染HBx过表达质粒导致C19MC基因簇和miR-1269b表达下调。由此,推测HBV通过HBx蛋白下调C19MC基因簇和miR-1269b的表达。接下来,生物信息学预测和qRT-PCR结果证明C19MC基因簇受上游甲基化岛的调控。转染HBx过表达质粒可上调甲基化转移酶DNMT3A和DNMT1的表达,证明HBx蛋白通过促进甲基化转移酶DNMT3A和DNMT1的表达,使C19MC基因簇上游甲基化岛过甲基化,从而抑制C19MC基因簇的表达。此外,利用qRT-PCR检测到HBx可以抑制miR-1269b初始转录本的表达。通过构建miR-1269b的启动子,双荧光素酶报告系统验证了 HBV和HBx蛋白对miR-1269b启动子的抑制作用以及HBx蛋白调控的转录因子NF-κB可以结合并抑制miR-1269b启动子。在此基础上,将NF-κB结合位点缺失的miR-1269b启动子与N F-κB过表达或敲降质粒共转,初步确定了 NF-κB对miR-1269b启动子的直接抑制作用。同时,通过qRT-PCR证明NF-kB抑制miR-1269b成熟体的表达。[结论]在HBV相关的肝细胞肝癌中,HBV病毒感染可以通过HBx蛋白影响宿主细胞的DNA甲基化水平和转录因子NF-κB,从而实现对C19MC基因簇和miR-1269b的抑制作用。此外,这是首次发现HBV可以影响miR-1269b的表达。这些发现,有利于我们进一步阐明,在HBV相关的肝细胞肝癌中,HBV病毒引起miRNA表达变化的机制,有助于我们更好的理解HBV感染与肝细胞肝癌发生发展的关系。