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致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)广泛存在于水产养殖中,致病范围广,呈现出世界分布的趋势。Ah引起的败血症、肠炎、皮肤溃烂等疾病给水产养殖带来了极大的经济损失,给我国乃至世界范围内的养殖户,带来极大影响。Ah引起的疾病多采用抗生素进行治疗,然而在实际生产中,对于发病后的检测,目前还没有一个比较健全的体制,因此也导致了抗生素滥用严重。由于大量抗生素被应用到环境中去,导致养殖水环境中抗生素残留严重,Ah耐药性逐渐提高,给防治带来了更大的困难。为探讨Ah耐药性机制,为实际生产提供理论基础,本研究通过诱导Ah耐药,采用基因组测序,比对分析的方法开展了以下工作:(1)为了解Ah全基因组信息的结构和功能,对AH10进行了全基因组测序。将提取的AH10全基因组DNA进行片段化、构建文库后上机测序;基因组组装后注释和比较分析。结果显示:AH10全基因组序列总长度为4.91Mb,GC含量为61.1%,共预测到4570个基因,3351个基因具有明确的生物学功能。共找到2592个基因具有直系同源族(Cluster of orthologous groups,COG)分类,1281个与代谢通路有关的基因,基因组岛31个。比较基因组学研究发现:AH10比对到SNP位点102481个,与Aeromonas hydrophila YL17基因结构共线性最好,与美国来源的Ah标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966具有较近的亲缘关系,AH10的致病性与溶血素基因hly(Hemolysin gene)、气溶素基因aer(Aerolysin gene)、黏附素基因ahal(Major adhesion gene)、丝氨酸蛋白酶基因ahp(Serine protease gene)、细胞兴奋性肠毒素基因alt(Cytotonic enterotoxin gene)密切相关。这些基因在Ah中同源性较高。存在自体诱导物信号分子-2(Autoinducer-2)与合成信号分子酶基因(Signal molecule synthetase gene ahyI)和转录调节蛋白基因(transcriptional regular gene AhyR)群体感应(Quorum sensing QS)系统,不存在III型分泌系统(type III secretion system TTSS)。(2)从五大类抗生素中各挑选出具有代表性的(一种或两种)抗生素,在针对Ah菌株AH10(CCTCC保藏号:AB2014155)的防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)的琼脂平板上,分别筛选出五株耐药菌株,并对筛选的耐药菌株进行交叉耐药性分析,制定出这些耐药菌株对常用抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)图谱。结果显示:分离的耐药菌株对所使用抗生素的MIC均提高100倍以上。4℃划线平板冰箱保存条件下,一个月内个别耐药菌株耐药性下降。在药物筛选压力下,菌株耐药性随着传代次数增多而表现出递增的趋势。同属一类抗生素耐药相关性较高;不同大类抗生素压力下筛选出来的耐药菌株表现出不同的交叉耐药性。(3)对强力霉素诱导的5株耐药菌株进行全基因组测序,并将基因组测序结果与原始菌株AH10和9株来自Genebank的Ah基因组信息进行比对,分析其差异性。结果显示:在14株菌株序列中,共包含有4730个基因,其中3056个核心基因。与原始菌株AH10相比,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和插入缺失标记(insertion-deletion,INDEL)较少,且这些SNPs和INDELs均不在编码区。但是拷贝数变异(copy number variation,CNV)和结构变异(structure variation,SV)较多。对其耐药基因检测发现:耐药基因差异多样性,bl1fox基因仅存在于4AK4中,5株耐药菌中只有AH104具有tetl基因,此基因在原始菌株AH10中并不存在。综上所述:Ah极易产生耐药性,耐药性一旦产生,将很难消失。耐药后,其交叉耐药性较为严重。耐药株突变较少且不在编码区,Ah的耐药性的形成可能不是主要由基因突变引起。结构变异和拷贝数变异较多,对基因结构影响较大,与耐药性的形成不无关系。水平的基因转移同时也参与耐药性形成过程中。耐药性形成由多个耐药机制共同参与,不同菌株形成的耐药机制不同,耐药机制复杂多变。