家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是二分DNA病毒科,二分浓核病毒属的唯一成员,并且是目前已报道的唯一自编码DNA聚合酶的二分型单链DNA病毒。其复制机制未知,可能采取类似腺病毒以蛋白起始的复制方式。病毒粒子为无囊膜包被的正二十面体结构,专性感染家蚕中肠柱状上皮细胞,引发家蚕罹患类似昆虫浓核病病症。BmBDV具有双义的基因组,包含两个线性单链DNA分子VD1和VD2。VD1含有4个开放阅读框(Open Reading Frame;ORF)(ORF1~ORF4),分别编码非结构蛋白NS2和NS1,主要结构蛋白VP以及DNA聚合酶PolB;VD2含有2个ORFs(ORF1、ORF2),分别编码非结构蛋白NS3和病毒次要结构蛋白P133。目前,BmBDV完整的基因转录策略仍然未知,极大地阻碍了病毒的感染和复制机理的研究。因此,本研究从病毒感染后的中肠组织中提取病毒RNA,通过RACE、RT-qPCR技术以及双荧光素酶报告系统分析病毒的转录谱的特征,最终首次获得该病毒完整的转录图谱。通过RT-PCR分析了病毒基因在不同时相上的转录情况,确定病毒感染后72 h为研究病毒基因转录的最佳时相并进行RACE实验。通过RACE技术确定病毒各基因转录本的大小和数量,重建了病毒cDNA的全序列。结果表明,VD1共产生4个转录本,VD2共产生2个转录本。每个ORF对应一个转录本,不存在转录本的选择性剪接。在VD1中,NS1/2基因产生两个独立转录本,但两个转录本共用一个典型的多聚腺苷酸化信号(AAUAAA),并且由两个重叠的启动子P5/5.5驱动。VP转录本5’端与NS1/2转录本的3’末端存在89 nts的重叠序列,由启动子P21驱动。PolB转录本与VP转录本在3’末端存在4 nts的重叠区域,由启动子P97驱动。在VD2中,NS3转录本和P133转录本分别由启动子P10和P89驱动,NS3转录本和P133转录本没有重叠区域。通过RT-qPCR定量比较分析NS1/2基因的转录本数量差异。设计了两对能区别转录本差异的引物(F1/R和F2/R),其中F2/R仅能特异性扩增NS2转录本,而F1/R引物既能扩增NS2转录本,又能扩增NS1转录本。分析结果表明,引物F1/R扩增产物的拷贝数明显多于引物F2/R,且在病毒感染的不同时相,通过引物F1/R获得拷贝数均比引物F2/R增加50%以上。这一结果进一步证明NS1/2基因能够产生两个独立的转录本。通过双荧光素酶报告系统研究NS1/2基因的两个重叠启动子(P5/5.5)的功能。我们将重叠启动子上游完整的功能元件以及下游的启动子调控元件的序列克隆至荧光素酶报告载体(pGL3-Basic),并对重叠启动子的关键功能元件进行定点突变。将构建的重组荧光素酶报告质粒转染到不同的昆虫细胞中,利用双荧光素酶报告系统检测启动子的活性。研究发现P5/5.5具有较低的活性,下游调控元件DPE(Downstream Promoter Element)能够增强启动子活性。NS1/2基因的转录由P5/5.5和DPE协同驱动。NS2的起始密码子(ATG)可能处于启动子的负调控区域,具有减弱启动子活性作用。通过Western检测NS1/2基因的共表达。将NS1/2基因序列克隆到真核表达载体pIB/V5-His中,构建NS1/2基因的共表达质粒。通过PCR在NS2基因序列的5’端融合HA标签的编码序列,使NS2和HA标签融合表达;通过突变NS1的终止密码子TAG至TAC,使NS1与载体自带的V5标签融合表达。将重组的共表达质粒pIB/V5-NS1/2转染Hi5细胞,通过Western检测到NS1和NS2蛋白的表达,表明NS1/2基因可以在Hi5细胞内共表达。