【摘 要】
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酪氨酸酶（tyrosinase,TY）是调节黑色素合成途径中的关键限速酶,其参与了各种生理代谢过程和疾病,如衰老,恶性癌症以及神经变性等。TY主要作用于黑色素生成途径中的单酚和邻二酚向邻醌的转化,当其活性过高或存在过量时,可能会导致黑色素的异常表达使其累积从而引发一系列皮肤病症,例如黄褐斑、色斑等。目前,TY抑制剂被用于皮肤的增亮和美容效果的增强,同时,TY抑制剂也是控制果蔬褐变的重要手段,但缺乏
【基金项目】
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食品科学与技术国家重点实验室项目（茶多酚抑制酪氨酸酶活性的分子机制及其与曲酸的联合抑制作用研究） 项目编号:SKLF-ZZB-201914； 南昌大学研究生创新专项资金项目（表没食子儿茶素没食子酸酯抑制酪氨酸酶的分子机制）项目编号:CX2019098；
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酪氨酸酶（tyrosinase,TY）是调节黑色素合成途径中的关键限速酶,其参与了各种生理代谢过程和疾病,如衰老,恶性癌症以及神经变性等。TY主要作用于黑色素生成途径中的单酚和邻二酚向邻醌的转化,当其活性过高或存在过量时,可能会导致黑色素的异常表达使其累积从而引发一系列皮肤病症,例如黄褐斑、色斑等。目前,TY抑制剂被用于皮肤的增亮和美容效果的增强,同时,TY抑制剂也是控制果蔬褐变的重要手段,但缺乏TY和抑制剂之间的相互作用的理解不利于天然TY抑制剂在化妆品和医药等行业中的实际应用,并且会进一步影响到新型TY抑制剂的发展前景。本文选取了儿茶素中最具代表性的三种酯型儿茶素,即表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）作为主要研究对象,通过联合多光谱学以及计算机模拟方法等现代分析手段系统地探究了这3种儿茶素对TY的体外抑制作用,酶促抑制动力学、结合性质以及构象影响,考察了三种儿茶素与曲酸（kojic acid,KA）之间两两联合使用对TY的活性抑制能力,研究了加热和超声波联合处理对GCG抑制TY活性的变化情况及机制。其主要研究内容及结果如下:1.EGCG、GCG和ECG对TY有较好的抑制效果,其半数抑制浓度值(IC50)分别为（3.94±0.54）×10-5 mol L-1、（3.68±0.21）×10-5 mol L-1和（1.13±0.82）×10-5 mol L-1,抑制能力强弱为:ECG>GCG>EGCG。EGCG、GCG和ECG对TY均表现为混合型抑制类型,三者的抑制常数分别是2.15?×?10-5 mol L-1、1.01?×?10-5 mol L-1和0.67?×?10-5 mol L-1。当EGCG、GCG和ECG与KA联合抑制TY的活性时,EGCG和KA表现为拮抗作用,GCG和KA表现为叠加作用,ECG与KA表现为协同作用,而儿茶素之间联用时均显示出协同作用。2.EGCG、GCG和ECG能够与Cu2+发生螯合作用,其结合常数分别为2.07×?10~4、1.05×?10~4和1.95×?10~4,结合能力强弱顺序为:EGCG>ECG>GCG,儿茶素可能通过螯合酶活中心的铜离子诱导酶的失活。EGCG、GCG和ECG主要在疏水作用力和氢键的主导下与TY形成基态复合物致使酶的内源荧光猝灭,且这3种儿茶素在TY上的结合位点仅存在一个,常温下,EGCG、GCG和ECG与TY的结合常数值分别为:1.59×?10~4 L mol-1、2.18×?10~4 L mol-1和4.03×?10~4 L mol-1,ECG对酶的亲和力更好,其次是GCG和EGCG。分子模拟和分子动力学模拟结果表明EGCG、GCG和ECG插入到TY的活性中心处,与铜离子和关键氨基酸残基相互结合,阻碍了L-多巴在活性位点的结合,复合物的形成诱导了局部区域氨基酸残基的波动,干扰了TY分子结构的稳定性,诱导了酶结构的变化,使得酶的催化能力降低。MM-PBSA分析表明疏水作用力在此过程中发挥主要作用,而氢键主要起到稳定复合物结构的作用。3.利用同步、三维荧光、红外光谱和圆二色谱研究了EGCG、GCG和ECG与TY的结合对其构象的影响。3种儿茶素对TY中酪氨酸残基和色氨酸残基周围的疏水性和极性影响无明显差别,同步荧光猝灭比率分析证明酪氨酸残基主要贡献于EGCG和ECG与TY的结合,而色氨酸残基在GCG与TY的结合中贡献更多。3D荧光结果证实EGCG、GCG和ECG与TY的结合作用导致了TY分子结构中多肽链的伸展,从而影响了酶的构象。圆二色谱和红外光谱结果表明,EGCG、GCG和ECG的存在诱导了TY中α-螺旋含量降低,β-折叠含量增多,因而导致TY构象的改变,使其分子结构更加松散,TY的催化功能因此减弱。这些结果表明EGCG、GCG和ECG的介入诱导TY二级结构发生改变,影响了构象稳定性,不利于底物进入酶活性位点,限制了酶催化能力的发挥,从而降低TY的催化活性。4.探究了加热和超声波前处理对GCG抑制TY活性的能力的影响,单独的加热处理（100℃,20 min）和超声波处理（630 W,60 min）都能提高GCG对TY的抑制能力,而加热和超声共同处理（100℃,20 min+630 W,60 min）抑制效果比单独处理组更好。经处理的GCG具有更强的荧光猝灭作用,猝灭常数前后比较:Ksv（处理后）>Ksv（处理前）,然而加热和超声波处理对GCG的猝灭机制没有影响,GCG与TY的结合仍是静态猝灭。受加热和超声波处理,GCG与TY之间的亲和力提高,但其结合位点数仍为1。热力学分析显示处理后其结合作用力方式未改变,疏水作用力仍是主要驱动力。高效液相色谱的定性分析进一步解释了加热和超声处理增强GCG抑制能力的内在原因。经过加热和超声波处理,部分GCG分解变成EGCG和GA,两种分解产物可与GCG联合促进对TY的抑制作用,从而使得GCG表现出更强的TY抑制能力。
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