细菌染色体DNA复制起始的第一步，也是最关键的一步，就是复制起始蛋白DnaA顺序结合到复制原点oriC中特定的识别位点(DnaA Box和AT-rich region)，继而形成开放性的复制起始复合物(open replication initiation complex)。这一过程是复杂有序而又受多种方式调控的。为了解细菌在高温条件下复制起始的分子细节及其热适应机理，本论文开展了高温细菌Thermoanaerobacter tengcongensm复制起始蛋白TtDnaA与其复制原点Tt-oriC在高温下相互作用的分子机理研究，进而解析了T. tengcongensis染色体复制起始的基本机制。　　 腾冲嗜热厌氧杆菌(T. tengcongensis)是我国自主分离并完成全基因组序列测定的第一个原核微生物。该菌具有一些有趣的特征，如它生长在70℃左右但GC含量较低(33％)；革兰氏染色阴性但基因组序列里含有革兰氏阳性细菌的特征基因；更值得一提的是，该菌86.7％的基因分布在复制前导链上；且含有两个潜在的引发酶和DNA聚合酶III。　　 为了研究腾冲嗜热厌氧杆菌的复制起始机制，克隆了其复制原点Tt-oriC，对其进行了精细的遗传分析，发现它含有12个散开分布的DnaA Box。采用RIP mapping的方法确定了其精确的复制起始位点位于DnaA Box8和9之间一段独特的AT—rich region上。接着克隆表达并纯化了复制起始蛋白TtDnaA，研究了TtDnaA与Tt-oriC之间在高温下的互作方式。发现在常温下，单独的TtDnaA蛋白的Domain IV(DNA binding domain)和一个DnaA Box就可以有效的相互作用，但在高温下必须要全长的TtDnaA蛋白和两个或两个以上的DnaA Box才能有效的相互作用，且随着两个DnaA Box之间距离的增加，其亲合力会降低，表面等离子共振实验(SPR)表明这个结合过程反应速率极快，且TtDnaA蛋白是高度寡聚化的。当把TtDnaA蛋白负责寡聚化的motif突变掉，则该突变体只能在常温下与Tt-oriC相互作用，而在高温下则丧失有效互作的能力。另外当腾冲菌TtDnaA蛋白的Domain IV置换成大肠杆菌DnaA的相应部分而Domian I—III不变时，突变体在低温下仍可以和Tt-oriC相互作用，但在高温下则不行。以上实验结果说明TtDnaA蛋白结合到多个紧邻的DnaA Box时的协同性，TtDnaA蛋白自身的寡聚化，以及TtDnaA蛋白高稳定性高亲合力的Domain IV对于其在高温下结合Tt-oriC是必需的。　　 进一步研究了复制起始位点所在的AT—rich region。采用SPR研究发现，只有ATP—TtDnaA蛋白能够与该AT—rich region特异结合，而ADP—TtDnaA则不行。有趣的是，紧临的DnaA Box6-8能大大增强这种相互作用。最后建立了体外复制起始解链复合物重构体系，分析发现只有ATP—TtDnaA蛋白，而不是ADP—TtDnaA或寡聚化缺陷的突变体，能在AT—rich region解开双链，确定了体外解链所需的最小区域仅包括DnaA Box1-8和AT-rich region。采用引物延伸分析方法，进一步确定解链所发生的精确位置正位于该AT—rich region，与体内复制起始位点测定结果完全吻合。这是国际上第一次较为精细的研究了高温细菌复制起始的分子过程及复制起始的热适应机制。