【摘 要】
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肠上皮屏障是一道物理性屏障,其结构的完整性和功能的正常发挥是抵抗外界物质入侵肠道以及维持肠道稳态的重要前提。大量文献显示,多种乳杆菌能够加强肠上皮屏障功能,保护肠上皮屏障免受外来损伤。表层蛋白（Surface layer protein,Slp）作为乳杆菌表层物质的一种,研究指出部分菌株的Slp通过与病原菌竞争黏附位点,拮抗肠细胞凋亡和炎症反应,减轻病原菌诱导的肠上皮屏障损伤。本论文研究多种乳杆菌
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肠上皮屏障是一道物理性屏障,其结构的完整性和功能的正常发挥是抵抗外界物质入侵肠道以及维持肠道稳态的重要前提。大量文献显示,多种乳杆菌能够加强肠上皮屏障功能,保护肠上皮屏障免受外来损伤。表层蛋白（Surface layer protein,Slp）作为乳杆菌表层物质的一种,研究指出部分菌株的Slp通过与病原菌竞争黏附位点,拮抗肠细胞凋亡和炎症反应,减轻病原菌诱导的肠上皮屏障损伤。本论文研究多种乳杆菌的Slp对TNF-α诱导的肠上皮屏障是否具有保护作用,以此揭示Slp对肠道功能的贡献,为进一步开发利用乳杆菌资源提供理论基础,也为肠道的健康干预提供新的思路。首先分离纯化获得了四株乳杆菌（Lactobacillus.acidophilus NCFM,L.acidophilus ATCC 4356,L.crispatus JCM 2009和L.fermentum CCFM 421）的Slp。通过Li Cl去除Slp后,黏附在Caco-2细胞上的四株乳杆菌数量显著降低（P＜0.05）,证实Slp参与乳杆菌菌体黏附肠道,这也是乳杆菌发挥益生功能的前提。以Caco-2细胞构建正常肠上皮屏障模型,以跨上皮电阻（Trans-epithelial electrical resistance,TEER）和细胞旁通路中异硫氰酸荧光素标记的右旋糖苷（Fluorescein isothiocyanate-labeled dextran,FITC-dextran）的通量为评价指标,发现四株乳杆菌的Slp能够以浓度梯度依赖性方式显著抑制TNF-α诱导的TEER的下降和FITC-dextran通量的增加（P＜0.05）,表明Slp通过抑制细胞旁通路通透性的增加,维持相邻肠上皮细胞间的紧密连接,保护肠上皮屏障结构的完整性。通过蛋白质免疫印迹法和免疫荧光染色技术发现,四株乳杆菌的Slp能够显著回调细胞内紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达水平（P＜0.05）,同时部分恢复TNF-α诱导的Occludin和ZO-1在细胞中的异常分布,证实Slp通过维持紧密连接功能,减弱TNF-α刺激引起的肠上皮屏障损伤。通过细胞活力测定和Hoechst 33342/PI双染发现,Slp能够显著拮抗TNF-α诱导的Caco-2细胞活力损伤和细胞凋亡（P＜0.05）,证实Slp对肠上皮细胞活性的保护作用。通过ELISA法测定Caco-2细胞内IL-8的含量,发现Slp能够显著降低TNF-α刺激引起的IL-8的分泌（P＜0.05）,提示Slp能够缓解TNF-α诱导的肠道炎症。利用免疫荧光染色技术发现,Slp能够抑制TNF-α诱导的NF-κB p65亚基核易位,使NF-κB处于失活状态,表明Slp对肠上皮屏障的保护作用是通过阻断NF-κB信号的激活来实现的。综上所述,四株乳杆菌的Slp通过阻断NF-κB信号通路,保持肠上皮细胞活性,以减缓TNF-α诱导的TEER的下降和细胞旁通透性的增加,回调紧密连接蛋白的表达和恢复紧密连接蛋白的分布,以及抑制肠道炎症,最终保护肠上皮屏障免受TNF-α的干扰。因此,本研究揭示出Slp对于肠上皮屏障的积极贡献,为后续进一步开发利用乳杆菌及Slp资源在胃肠道方面的应用提供理论基础。
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