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背景:人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV),经感染人体后可导致获得性缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)。联合抗逆转录病毒治疗(Combination Antiretroviral Therapy,cART)的运用,可以使 HIV-1 感染者体内的病毒复制数低于常规检测水平线以下,但不能使其完全清除。治疗HIV-1感染的主要困难就是清除这群潜伏的整合且具有复制能力的病毒储存库(viral reservoir)。目前对于检测病毒储存库方法很多,但是各有不足,如何能更精确快速找到病毒储存库,本研究论文提出问题,并且在目前被视为检测病毒储存库金标准的方法—体外扩增检测(viraloutgrowthassay,VOA)的基础上进行改进。由于HTV-1的生物学特性的复杂,目前尚无有效疫苗。对于HIV的研究,特别是HIV-1抗逆转录病毒治疗后,HIV-1感染变成慢性病,各种并发症的研究,需要动物模型。本文基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及利用dCas9基因激活系统与EcoHIV相结合,改进HIV啮齿类细胞模型。目的:本文基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型。方法:利用Crispr/Cas9改造后的dCas9基因激活系统,根据其设计原理,在HIV-1的长末端重复序列(LTR)设计20条sgRNA。首先分别测试20条sgRNA的激活能力,并筛选出2条效率较高的sgRNA进行对比,确定效率最佳者。其次将此条sgRNA与dCas9基因激活系统导入Jurkat细胞经筛选建立激活系统细胞系;利用含荧光素酶报告基因的感染Jurkat细胞,构建HIV潜伏细胞系。将潜伏细胞系与激活系统细胞系,按照预先设定的潜伏频率共培养7天和14天后测试激活能力,并与HIV激活剂对比激活能力。测试在鼠类细胞中存在HIV激活系统时,EcoHIV能否在鼠类细胞中完成病毒感染,复制,再感染的病毒增殖循环。结果:筛选出两条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O。通过对比试验,gRNA-L和gRNA-O分别促进Jurkat6465-Luc的扩增效力,在第6天测定gRNA-L和 gRNA-O 荧光素酶活性强度(pg/ml)(85530±979.2,n=3)和(96925±2759,n=3)明显比对照(9876±437,n=3)高(P<0.01);最后选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏模型细胞,在第7天、第14天激活HIV潜伏模型细胞的频率测定分别1/864和1/755,比传统激活剂第14天激活HIV潜伏模型细胞的频率1/1180更接近设定值;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照1/749相比更接近于设定频数1/500。dCas9基因激活系统能激活Eco-HIV感染的大鼠C6细胞系,未感染Eco-HIV组中荧光素酶活性强度(RUF)C6-6465-L(74.67±5.812,n=3),C6-6465-O(84±8,n=3)与对照 C6-6465-对照(86.67±3.528,n=3)相比无统计学意义;Eco-HIV感染组中 C6-6465-L(2839±25.75,n=3),C6-6465-0(3173±61.2,n=3)与对照C6-6465-对照(105.3±3.528,n=3)相比p<0.01,有统计学意义。其次,dCas9基因激活系统能激活Eco-HIV感染的小鼠BsB8细胞系。感染Eco-HIV的BsB8-6465-L 荧光素酶活性强度(RUF)(929.7±11.55,n=3)比 BsB8-6465-对照(179±12.49,n=3)与空白组(169.3±8.353,n=3)相比p<0.01,有统计学意义。最后,dCas9基因激活系统激活的Eco-HIV感染的大鼠C6细胞,再感染C6细胞后仍能进行转录复制,荧光素酶活性强度(RUF)C6-LTR-L(788±41.63,n=3),C6-LTR-O(836±28.1,n=3),C6-LTR-空(85.33±7.055,n=3)分别与 C6 无感染(83.67±8.11,n=3)相比p<0.01,p<0.01,N,实验组有统计学意义。结论:本研究进一步改进了 HIV体外病毒扩增方法,准确有效地启动病毒转录并促进其转录达到可检测水平,使得静息潜伏病毒激活检出率较传统方法提高。本研究同时也解决了 EcoHIV鼠细胞模型不能进行转录复制的难点。