肝糖原是哺乳动物体内重要的能量储存物质。糖原在体内分布广泛,人体内主要集中在肝脏和骨骼肌,其中肝糖原能够维持体内的血糖平衡。从结构上来看,糖原是由葡萄糖单体组成的高度分枝化的高分子物质,可以划分为三种不同的结构层级:一级结构由葡萄糖单体通过α-(1,4)键形成直链,通过α-(1,6)键形成支链,平均支链的长度大概是12个葡萄糖单体;二级结构由这些直链和支链连接成β粒子,直径大概在20 nm左右;三级结构是由β粒子连接成的更大粒径的α粒子,直径大概在100 nm。本课题研究集中在第三级结构层面,主要研究肝糖原小粒径β-粒子结合成大粒径α-粒子的蛋白质。通过对比db/db小鼠(一种二型糖尿病模型)的肝糖原与正常小鼠肝糖原的结构差别,找出肝糖原结合蛋白并研究这种差异与肝糖原结合蛋白的定性定量关系,以期寻找治疗糖尿病的新型药物靶点。本论文由四个部分组成。第一部分,建立将肝糖原分子与其表面结合蛋白分离纯化的可行性方法。第一:使用胰蛋白酶将肝糖原表面结合蛋白降解成多肽,并通过超滤离心管(MWCO)除去,同时用分析型体积排阻色谱(SEC)检验肝糖原是否会降解;第二:使用制备型SEC根据肝糖原分子与蛋白质分子大小的差异来分离纯化肝糖原。然后,将两种方法分离纯化得到的肝糖原使用α-淀粉酶降解以释放肝糖原分子当中所有的蛋白质,再用高分辨质谱仪(Triple-TOF)进行蛋白质组学检测,以蛋白组学数据中含有肝糖原相关蛋白最少者确立为最佳分离纯化方法。经过蛋白质组学定性分析,发现经胰蛋白酶降解方法纯化的肝糖原分子仍可以结合多种杂质蛋白;但是经制备型SEC纯化之后的肝糖原只含有一种与肝糖原分子相关蛋白-glycogenin,其余为实验操作过程当中掺入的杂质蛋白。发现通过制备型SEC纯化后的肝糖原分子具有最纯净最准确的蛋白质组。第二部分,在体外通过转基因技术表达出被检测出的肝糖原连接蛋白,并进行体外验证实验,确认该连接蛋白能够成功将小粒径β-粒子连接成大粒径的α-粒子。通过转基因技术将表达该蛋白的基因剪切进大肠杆菌质粒载体中,并将该载体转染入大肠杆菌中进行培养,表达出目标蛋白,然后通过多种手段检测蛋白活性并降解掉其表面的多糖,再与小鼠体内提取出的肝糖原进行混合反应,检测肝糖原粒径大小,以提供该肝糖原结合蛋白作为肝糖原连接分子的直接证据。Glycogenin分子具有多糖连接活性,通过体外培养实验验证该结论并研究其连接机制,目前仍在进行中。第三部分,采用蛋白组学分析方法,寻求将小粒径β-粒子连接成大粒径α-粒子的关键蛋白。然后将所得到的蛋白质进行定量实验,探索在相应质谱条件下对痕量蛋白质进行定量的可行性,并确认可靠的定量条件,比较糖尿病小鼠和正常小鼠体内该连接蛋白的定量差异。提出糖尿病肝糖原的病理结构模型,并使用SEC和荧光辅助毛细管电泳(FACE)等多种检测手段对该病理模型进行验证。经定量蛋白质组学分析,发现糖尿病小鼠的肝糖原与正常小鼠体内肝糖原的连接蛋白在β-粒子分子内部存在显著差异,前者肝糖原β-粒子内部的glycogenin蛋白即使不经α-淀粉酶处理也能被胰蛋白酶所降解,而后者却能保护内部glycogenin分子免受外界胰蛋白酶的作用。提出了糖尿病小鼠肝糖原的病理模型(如图20所示),相对疏松的肝糖原分子结构是造成其较为脆弱的关键。第四部分,本文从肝糖原的纯化方法的意义,肝糖原的结构研究对糖尿病的启示以及下一步工作重点等内容对全文进行总结并对将来工作重点进行展望。