木质纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源,实现木质纤维素的高效转化够解决人类面临的能源和资源问题,实现人类的可持续发展。在木质纤维素的转化过程中需要多种糖苷水解酶的协同作用,糖苷水解酶GH5家族被称为“纤维素酶家族A”,在数量上是非常庞大的糖苷水解酶家族。基于序列一致性,GH5家族被分为51个亚家族。随着蛋白质组学和结构生物信息学的发展,基于序列和结构信息的活性架构序列谱对纤维素酶进行理性改造,有助于探究纤维素酶与底物之间的结合、催化断键和产物释放机制,阐明其中的共性规律,为实现纤维素的高效转化奠定坚实的理论和应用基础。本文以糖苷水解酶GH5-2亚家族的ChCel5A为研究对象,对其活性架构中起关键作用的完全保守氨基酸和相对保守的芳香族氨基酸进行定点突变和理化性质的分析,寻找纤维素酶降解底物时的规律。本文的研究内容及主要结果如下：1、对GH5-2亚家族的纤维素酶进行了生物信息学分析,找到完全保守氨基酸的N165、Y227和相对保守芳香族氨基酸W61、Y203。对整个GH5-2亚家族有结构的酶分子进行了生理生化性质的统计,显示GH5-2亚家族的酶分子具有较宽的温度和pH的适应范围。该家族的拓扑结构为Tm桶,即(β/α)8桶结构,活性架构具有较强的负电性,嗜热酶的带电性基本强于中温酶和低温酶的带电性。根据活性架构序列谱以及ChCel5A与底物距离为5A的原则,找到完全保守氨基酸N165、Y227和相对保守芳香族氨基酸W61、Y203进行研究,该项研究为后续的实验工作奠定了基础。2、对ChCel5A活性架构中保守氨基酸进行了突变和功能分析,发现保守氨基酸的突变能够改变酶分子的最小结合糖单元。通过糖苷水解酶GH5家族的活性架构序列谱中的N165和Y227,都位于-1位亚位点,推测对于维持酶活力具有非常重要的作用,因此通过定点突变和大肠杆菌异源表达的方法进行N165A和Y227A的功能分析。N165A和Y227A突变体的CMC酶活均降低90%以上,说明完全保守氨基酸对于维持酶分子的催化活性具有至关重要的作用。对N165A和Y227A降解RAC的产物谱进行分析,发现随着反应时间的增加,主要产物是纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖,而野生型蛋白的主要产物中没有纤维四糖,说明N165A和Y227A突变体的最小结合糖单元不再是纤维四糖而是纤维五糖,说明完全保守氨基酸的突变能够改变酶分子的最小结合糖单元以及作用模式。3、通过突变和功能分析发现,ChCel5A活性架构中-2亚位点氨基酸对维持酶功能具有更加重要的作用。W61位于ChCel5A活性架构-2亚位点,Y203位于+1亚位点,是其活性架构中的相对不保守氨基酸。W61Y的CMC酶活降低降低了72%。W61Y的Km升高,kcat降低,说明W61Y的突变使酶分子与底物间的结合力降低,产物释放变慢。从结构上分析,W61是ChCel5A活性架构中5A范围内的氨基酸,将W61突变成Y后,其与-2位糖环中C6的距离为8.2A,其与底物失去了相互作用,最终影响了酶活；Y203W的CMC酶活降低了68%,从结构上分析,Y203与+1位的C3形成一个氢键,突变成W之后,W与底物不会形成氢键有利于产物释放。Y203W的Km升高,kcat也升高,但kcat/Km降低,说明kcat的升高不足以弥补Km的升高对酶活造成的影响,从而酶活降低。-2亚位点W61Y的酶活改变较+1亚位点的Y203W明显,且产物谱中降解四糖的能力减弱,因此-2亚位点对于维持酶活力具有重要的作用。4、利用荧光光谱法测定了ChCel5A活性架构中亚位点氨基酸与底物的结合力,同时发现pNP类物质不适宜作为底物来表征纤维素酶的性质。酶分子中的色氨酸可以被295nm的激发光激发,当酶分子与底物相互作用后导致荧光淬灭,根据Stern-Volmer方程计算出色氨酸与底物之间的结合常数和结合力。本文利用荧光光谱的方法测定了ChCel5A活性架构中关键芳香族氨基酸(W61Y、W287A、Y203W)与三种底物(p NP、pNPC、CMC)的结合常数,分析了ChCel5A中单个芳香族氨基酸的突变对于底物结合力的影响,并且证明该方法在整个GH5、GH12家族中具有普适性。ChCel5A以及三种突变体与pNP、 pNPC的K8值大于与CMC的Ka值,说明pNP类物质能够高估结合常数约100-500倍,定量表明了pNP类物质作为底物来表征纤维素酶的性质是不合适的。