枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的发酵优化及酶学特性研究

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出发菌株枯草芽孢杆菌FB14产普鲁兰酶的初始水平为110.34U/mL。通过紫外诱变,获得了高产菌株FB14-35,产量高达166.85U/mL。在此基础上进一步等离子诱变,获得高产菌株FB14-35-11,产酶水平高达216.53U/mL,相对出发菌株产酶水平提高了 96.24%。FB14-35-11普鲁兰酶发酵进行优化。采用培养基单因素优化、氮源均匀设计优化和发酵条件单因素优化,确定了最佳的发酵培养基配方:麦浆10%、玉米浆0.8%、(NH4)2S04 0.1%、尿素 0.275%、KH2PO4 0.5%、K2HP04 0.25%。最佳发酵条件:接种量1%、转速220r/min、初始pH7.0、温度34℃。通过发酵优化后,最终该菌的产酶量可达259.62U/mL,比优化前(216.53U/mL)提高19.90%。FB14-35-11普鲁兰酶发酵的代谢过程研究表明,该酶的生物合成与菌体生长为部分偶联型,成功构建普鲁兰酶发酵的菌体生长、酶生物合成与发酵底物消耗动力学模型,获得模型参数估算值为:μmaz=0.1378h-1 α=59.06,β =-4.59;Yx/S=0.418 g.g-1,Ms=0.00886 g.g-1·h-1。普鲁兰酶的酶学特性研究结果表明:该酶最适作用温度为60℃、最适作用pH为5.5;在温度≤55℃、pH7.0-7.5具有较好稳定性。以普鲁兰多糖为底物,对其酶反应的动力学研究结果表明,普鲁兰酶催化普鲁兰多糖底物的米氏常数Km为1.38 g/L,最大反应速率Vm为10.62μg/mL·min,水解普鲁兰多糖反应的活化能(Ea)为17.08kJ/mol。不同效应物对普鲁兰酶的影响研究表明,一价金属离子对其影响不大;二价离子中Zn2+对其影响不大,Mg2+和Ca2+具有一定的促进作用,Cu2+具有强的抑制作用;三价金属离子(Fe3+、Al3+)对其均有很强的抑制作用;除丙酮和低浓度的乙醇外,其它有机溶剂对酶都有不同程度的抑制作用,只有低浓度的乙醇对其有一定的促进作用;大部分蛋白质基团修饰剂对普鲁兰酶都有不同程度的抑制作用,初步判断该酶的活性基团包括:赖氨酸e-氨基、丝氨酸、蛋氨酸等氨基酸残基。磁性Fe3O4纳米颗粒固定化普鲁兰酶研究表明,采用无水乙醇-正硅乙酯修饰磁性Fe3O4纳米颗粒作为载体,其吸附率可达50%。酶固定化条件优化结果表明,酶与载体比例为3:100mg/mg、pH为5.0、固定化时间为10h,其固定化率可达到55.16%。固定化酶的酶学特性的研究结果表明:最适的反应温度为60℃、pH4.5,在60℃、pH≤4.5条件下保持着较高稳定性,其耐热耐酸性较游离酶明显改善;该固定化酶重复利用14次,仍然有较高的酶活,说明该固定化酶的重复稳定性较好。
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