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硫酸舒欣啶(sulcardinesulfate,sul)化学名为4-甲氧基-N-[3,5-双(1-吡咯烷甲基)-4-羟基苄基]苯磺酰胺硫酸,是由中科院上海药物研究所研发的一种具有抗心律失常活性的新结构类型药物。前期研究表明硫酸舒欣啶对多种实验性室性心律失常模型有效。本论文通过制备大鼠心房纤颤动物模型,并运用多种电生理技术研究了硫酸舒欣啶的抗心房纤颤作用及其电生理机制。
1.硫酸舒欣啶抗实验性大鼠心房纤颤作用
我们采用电刺激法制备大鼠心房纤颤(房颤)模型,通过比较房颤持续时间评价药物的抗心律失常作用。生理盐水组房颤持续时间为24.86(19.00,28.36)秒,1mg/kg奎尼丁组持续时间为0(0,0)秒、硫酸舒欣啶0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg组房颤持续时间分别为16.03(11.30,24.16)秒、4.96(2.48,13.74)秒、0(0,2.30)秒。1mg/kg奎尼丁组、硫酸舒欣啶1mg/kg、3mg/kg组与生理盐水阴性对照组相比房颤的持续时间显著降低(Nermenyimultiple comparison:P<0.05,n=10)。
2.硫酸舒欣啶对大鼠心房组织跨膜动作电位的作用
我们采用心房肌组织标本跨膜动作电位记录方法研究硫酸舒欣啶对大鼠心房组织跨膜动作电位的作用。实验结果表明30μM及100μM硫酸舒欣啶使大鼠心房组织跨膜动作电位最大上升速率(Vmax)分别下降至给药前的79.4％±6.7％(P<0.05,n=6),68.0±6.8％(P<0.05,n=6)；而使动作电位时程(APD90)分别缩短至给药前的84.1％±4.8％(P<0.05,n=6),72.3±7.7(P<0.05,n=6),有效不应期(ERP)则分别延长为给药前的161.5％±21.9％(P<0.05,n=6)、206.0％±16.4％(P<0.01,n=6)。
3、硫酸舒欣啶对Na+电流(INa)、瞬时激活K+电流(Ito)、Ca2+电流(ICa)及稳态K+电流(Iss)的影响
我们采用Langendorff离体心脏逆行灌流技术分离大鼠心房肌细胞,并采用全细胞膜片钳技术研究了硫酸舒欣啶对心房肌细胞INa、Ito、ICa、Iss的影响。硫酸舒欣啶对INa、Ito、ICa的半数抑制浓度分别是11.2μM(n=5-8)、11.2μM(n=6-7)、63.8μM(n=6),300μM硫酸舒欣啶对,Iss无明显抑制作用(n=8)。
4.硫酸舒欣啶对hNav1.5、hERG、hKv1.5通道的作用
我们制备了稳定表达hNav1.5、hERG、hKV1.5通道的HEK293细胞模型,采用全细胞膜片钳技术研究硫酸舒欣啶对hNav1.5、hERG、hKv1.5通道的作用。硫酸舒欣啶能剂量依赖性地抑制hNav1.5通道(IC50=15.0μM,n=7),并可使失活曲线半数失活电位(Vh)从-81.5±1.3mV移到-89.7±6.2mV(P<0.01,n=6)。当膜电位钳制在-65mV时,IC50为8.8μM(n=8),而当膜电位钳制在-120mV时,仅300μM的浓度能显著抑制hNav1.5通道(8.2％±1.7％,P<0.05,n=5),在1-300μM的浓度范围,IC50不能被求出。这些结果提示硫酸舒欣啶对失活态hNav1.5通道作用明显。硫酸舒欣啶30μM能使失活后恢复时间常数(τ)从54.3±2.5ms延长为111.9±13.6ms,表明硫酸舒欣啶能使hNav1.5通道失活后恢复时间延长(P<0.01,n=6)。硫酸舒欣啶频率依赖性抑制实验表明高频刺激能使硫酸舒欣啶的抑制作用累加,硫酸舒欣啶对hNav1.5的抑制作用具有频率依赖性(n=7)。
硫酸舒欣啶能剂量依赖性地抑制hERG通道(IC50=94.3μM),100μM硫酸舒欣啶可使I-V曲线向超极化方向移动(n=10)。包络实验表明,100μM硫酸舒欣啶能使时间常数(τ)从283.1±19.7ms缩短至201.1±21.8ms(P<0.05,n=6)。使用依赖性抑制实验表明,在通道开放时,硫酸舒欣啶并没有显示出抑制作用,随着开放时间的延长,抑制作用迅速增强(n=5)。状态依赖性实验表明硫酸舒欣啶对hERG通道的抑制发生在去极化状态(+80mV),在复极态(0mV)时没有发生随时间增强的抑制作用(n=6),这表明硫酸舒欣啶的抑制作用在去极化状态时即达到最大。以上数据表明硫酸舒欣啶主要抑制开放态及失活态的hERG通道。
硫酸舒欣啶100μM及300μM均不能有效抑制hKv1.5(P>0.05,n=9),300μM硫酸舒欣啶不能有效影响hKv1.5的电压.电流(I-V)关系(n=9)。
5.常咯啉对大鼠心室肌细胞的电生理性质的作用
我们采用Langendorff离体心脏逆行灌流技术分离大鼠心室肌细胞,并采用全细胞膜片钳技术研究常咯啉对大鼠心室肌细胞的电生理性质的作用。常咯啉对Ito的抑制作用轻微,仅300μM的浓度可以抑制31.1％±4.1％(P<0.05,n=7)。常咯啉呈剂量依赖性地抑制大鼠心室肌细胞Na+通道(IC50=10.2μM,,n=6-7),并能使失活曲线的半数失活电位(Vh)从-90.1±2.3mV移到-102.2±7.3mV(P<0.01,n=7)。当Na+通道钳制在-65mV时,常咯啉对Na+通道的IC50为6.65μM(n=6),但当钳制电位为-130mV时,仅仅100μM的浓度能明显抑制Na+通道(13.5％±4.2％；P<0.05,n=6),在1-100μM的浓度范围,IC50不能被求出。这些实验结果表明,常咯啉主要作用于Na+通道失活态。Na+通道失活后恢复实验表明,常咯啉10μM能使恢复时间常数(τ)从89.6±9.0ms延长至117.4±12.2ms(n=8,P<0.01)。频率依赖性抑制实验表明高频刺激能使常咯啉的抑制作用累加,常咯啉对Na+通道的抑制作用具有频率依赖性(n=7)。常咯啉对Ca2+通道具有剂量依赖性地抑制作用(IC50=74.7μM,n=6)。
6.常咯啉对hERG通道的抑制作用
常咯啉对hERG通道具有剂量依赖性的抑制作用(IC50=18,2μM,n=6),30μM常咯啉可使I-V曲线(N=6)及激活曲线向超极化方向移动(n=9),包络实验表明,30μM常咯啉使时间常数(τ)从287.8±46.2ms缩短至174.2±18.4ms(P<0.05,n=7)。这表明去极化时程的延长可促进常咯啉的抑制作用。使用依赖性抑制实验表明,在通道开放时,常咯啉并没有显示出抑制作用,随着开放时间的延长,抑制作用迅速增强(n=5)。常咯啉对hERG通道的抑制发生在去极化状态(+80mV),在复极态(0mV)时没有发生随时间而增强的抑制作用(n=6),因此常咯啉的抑制作用在去极化状态时即达到最大。这说明常咯啉主要抑制开放态及失活态的hERG通道。并且常咯啉可加速hERG通道的失活过程(P<0.05,n=7)。
本论文实验结果表明硫酸舒欣啶能有效抑制大鼠实验性心房纤颤,并能降低大鼠心房肌组织跨膜动作电位最大上升速率(Vmax),延长有效不应期(ERP),缩短动作电位时程(APD)；硫酸舒欣啶能抑制大鼠心房肌细胞INa、Ito、ICa；硫酸舒欣啶对hNav1.5通道具有浓度及状态依赖性的抑制作用,对hERG通道具有轻微的抑制作用,对hKv1.5通道不具备抑制作用；常咯啉对大鼠心室肌细胞INa具有较强抑制作用,对ICa具有一定抑制作用,对Im抑制作用轻微；常咯啉对hERG通道具有较强的状态及浓度依赖性抑制作用。