由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)侵染导致的黑胫病、根黑腐病是严重威胁烟叶生产的两种土传病害,在烟田常混合发生而造成更加严重的损失。准确鉴定病原菌对病害诊断和及时制订针对性的防治措施有重要意义。本试验以病原菌ITS为靶标序列,建立了烟草疫霉、根串珠霉的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),不仅检测结果肉眼可视、特异性与灵敏性强,而且反应条件简单。主要研究结果如下。以羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)为染料,以烟草疫霉的核糖体转录间隔区域ITS为靶标序列,应用LAMP设计软件设计4条引物,通过优化LAMP反应体系,建立了烟草疫霉LAMP快速检测体系(Phy-LAMP)。该体系的检测结果可直接通过反应液颜色变化判断,并用2%琼脂糖凝胶电泳验证检测结果。本研究对建立的体系进行特异性和灵敏度验证,并对田间采集的疑似病株及其根际土壤进行检测。结果表明:优化的Phy-LAMP反应体系,在特异性检测中,只有烟草疫霉LAMP检测反应液呈蓝色(阳性反应),其它对照病原菌LAMP检测反应液颜色均呈紫色(阴性反应);灵敏度结果表明,LAMP检测灵敏度可检测到100 fg/μL,比普通PCR灵敏度提高了1000倍。对5份疑似病株样本提取的DNA进行检测,检测到3份样本为阳性,且阳性病株样本常规组织分离均分离到烟草疫霉;病株根际土壤样品DNA检测结果与病株检测结果一致。在室内培育的烟苗上人工接种烟草疫霉2 d,即可用LAMP法检测到目标菌。以SYBR Green I为染料,以根串珠霉的ITS序列为目标基因序列,应用LAMP设计软件设计4条引物,通过优化LAMP反应体系,建立了根串珠霉LAMP快速检测体系(Tb-LAMP)。该体系的检测结果可直接通过反应液颜色变化判断,并用2%琼脂糖凝胶电泳验证检测结果。本研究对建立的体系进行特异性和灵敏度验证,并对田间采集的疑似病株及其根际土壤进行检测。结果表明:优化的Tb-LAMP反应体系,在特异性检测中,只有根串珠霉LAMP检测反应液呈黄绿色(阳性反应),其它对照病原菌LAMP检测反应液颜色均呈橙色(阴性反应);灵敏度结果表明,LAMP检测灵敏度可检测到1 pg/μL,比普通PCR灵敏度提高了10倍。对10份疑似病株样本提取的DNA进行检测,其中2份样本为阳性,且阳性样本使用胡萝卜圆片法分离到根串珠霉,从病株根际土壤提取DNA的检测结果与病株的检测结果一致。本试验建立的烟草疫霉与根串珠霉LAMP检测体系,具有较好的特异性与灵敏性,可有效检测到烟株病组织及其根际土壤中的目标菌,为病害诊断提供了可靠的技术手段,对病害及早采取防治措施具有积极意义。