透明质酸低pH区成胶机理研究

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透明质酸是一种化学结构简单但却具有着复杂理化性质的酸性粘多糖,是糖胺聚糖家族中的重要成员。它在脊椎动物的生命活动中发挥着举足轻重的作用,具有多种生物活性,广泛应用于医药、化妆品以及健康食品等行业当中。各国学者对其各种理化性质、生物活性的研究方兴未艾。但美国Balazs博士发现的一个特性至今未能系统阐述其形成机理,也一直未被应用:在低pH区域非常窄的范围内能够形成弱凝胶,在高于或低于这一区域弱凝胶现象消失。本文首先采用流变学方法对其成胶机理进行了定性研究,建立了水溶胶网络结构的定量方法并成功应用于透明质酸成胶机理的定量研究中;接着利用分子动力学模拟技术以及圆二色光谱技术对其成胶机理进行了印证和补充;最后为了进一步验证成胶机理进行了核磁共振、光散射、电镜扫描、实际应用探索等一系列实验。首先,采用氯化钠以及氢键破坏剂尿素确定了弱凝胶形成的主要驱动力为透明质酸链间的氢键作用力而不是离子力。通过具有相同基团的结构类似小分子与高分子透明质酸链的竞争实验确定了形成这种起关键作用的氢键基团为葡萄糖醛酸上的羧基和乙酰氨基葡萄糖上的氨基。这两种基团间形成的氢键使得相邻透明质酸分子链间形成了双螺旋结构并最终导致了覆盖整个体系的刚性网络。其次,建立了一种定量化测定水溶胶体系中的网络结构的流变学方法。通过测定水溶胶的应力松弛时间谱计算缠绕式网络结构的数量为:借助于这一方法成功研究了透明质酸浓度与缠绕式网络的关系、温度、pH、小分子的浓度等缠绕式网络结构的量化关系,如:网络数量与浓度的关系为N=10.686e8.4370C55.04,网络数量与温度的关系为:N=3976.9e0.09788T,网络数量与尿素浓度的关系为:N=1456.8e0.7534C(C≤5%)、N=57.891e0.0885C(C≥5%)。该方法能为研究各种因素对透明质酸溶液中网络结构的影响提供了更为客观的评价。检测工作能在旋转流变仪上完成,具有简单、方便等优点。另外,对离子化和质子化的透明质酸链进行了分子动力学模拟,结果发现质子化的透明质酸形成的双螺旋结构比离子化的透明质酸形成的双螺旋结构具有更好的稳定性和刚性。Putty(透明质酸的弱凝胶状态)的形成恰是发生在透明质酸链离子化率为11%-39%,这时具有较高刚性的双螺旋结构形成的网络能覆盖整个体系,形成putty;并且在离子化率为22%时putty的凝胶强度达到最大值。圆二色光谱的研究印证了双螺旋结构的存在,并讨论了pH、温度等对双螺旋结构的影响。在透明质酸成胶机理的研究过程中,还采用了核磁共振NOE测定技术、低场核横向弛豫时间T2测定技术、激光光散射技术以及扫描电镜微观分析技术对透明质酸的成胶机理进行了讨论性研究。鉴于其成胶的特性,这些方法还需要不断的改进和提高。最后对具有这一特性的透明质酸在食品中的应用进行了初步的探索。透明质酸低pH区的成胶机理如下:作为弱电解质的透明质酸在中性和酸性pH条件下只能发生部分解离,因而透明质酸链上既存在质子化的羧基也存在离子化的羧基;在中性环境中大部分羧基以离子化形式存在,分子间静电斥力比较大,但在浓度较高时由于分子间的氢键特别是羧基与乙酰氨基形成的氢键使得透明质酸链之间形成双螺旋结构并形成网络结构,但这种双螺旋结构刚性较差,稳定性较低,因而溶液的凝胶强度不高;随着pH值的降低,更多的羧基被质子化,离子化透明质酸链形成的双螺旋结构渐渐被质子化透明质酸形成的双螺旋结构所替代,局部网络的刚性不断增强。当离子化率小于39%的时候刚性双螺旋结构形成的网络逐渐覆盖整个体系,体系的凝胶强度显著增强。当离子化率达到22%时覆盖整个体系的网络刚性达到最大。pH的持续降低使质子化进程进一步进行,网络刚性继续增加;同时刚性双螺旋结构占比增加使构成网络的网孔不断变小,当离子化率小于11%时刚性网络难以覆盖整个体系,弱凝胶现象消失。刚性网络在体系中仍然阻碍了水分子的自由运动因而整个体系具有相当高的粘性。过量的氢离子和氨基作用使得糖链上正电荷增加,因此虽然透明质酸糖链之间发生聚集但不会形成沉淀。
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