研究背景骨肉瘤是一种最常见的原发性恶性骨肿瘤,主要发病在20岁以下的青少年,其具有恶性度高、生长快速、侵袭力强,易发生早期转移等肿瘤学特征,预后差死亡率高。目前骨肉瘤的治疗以新辅助化疗以及化疗周期间肿瘤的广泛切除法为主,多模式相结合的治疗方法将患者的五年生存率明显提高,但是仍然不理想。因此,如何寻找骨肉瘤有效的诊断方法和新的治疗或者联合治疗策略迫在眉睫。重构剪切因子1(remodeling and spacing factor1,RSF1),也称为乙型肝炎X-抗原相关蛋白(HBXAP),是ATP依赖性染色质重塑因子5的家庭成员。RSF1与蔗糖非发酵蛋白2同源(hSNF2H)相互作用形成RSF-1/hSNF2H复合物,其反过来通过调节核小体重塑在不同的生物和病理过程中起作用,包括调节转录,DNA复制和细胞周期等。最近,在实体肿瘤的研究中被发现RSF1具有异常表达和功能障碍。研究显示,RSF1在肾癌中高表达并且同肿瘤的TNM分期,预后不良等显著相关;RSF1在肺癌中高度表达。降低肺癌细胞中RSF1的表达能够导致肺癌细胞停滞在G1期,同时增加细胞的凋亡,抑制细胞的侵袭能力。除此之外,降低RSF1能够增加肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但是关于RSF1在骨肉瘤中的作用及可能机制仍不清楚。因此探讨RSF1在骨肉瘤中的表达情况、以及其上游基因及可能存在的调节方式具有非常重要的临床意义。随着骨肉瘤形成表观遗传学机制的研究,人们越来越意识到非编码RNA、DNA甲基化、组蛋白修饰以及染色质重塑等过程在骨肉瘤形成及进展中所发挥得重要作用。非编码RNA是一类非蛋白质编码转录物,可以根据其功能或长度进行划分。短链非编码RNA主要包括microRNA,siRNA,piRNA等,其中microRNA参与了许多肿瘤的发生发展,是基因表达的重要调节因子。miRNA通常在不同类型的人类肿瘤中上调或下调,作用于不同靶点调控肿瘤细胞增殖、侵袭。例如miRNA-154参与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和代谢,并可通过作用于RSF1抑制膀胱癌细胞;miR-193a-3p也在多种肿瘤中呈现异常表达,在肺癌中,miR-193a-3p通过下调ERBB4从而发挥抑制肿瘤的作用,miR-193a-3p通过下调Rab27B抑制骨肉瘤细胞的转移。miRNA在骨肉瘤中既是原癌基因又是抑癌基因,通过调控其靶基因来影响骨肉瘤细胞的表型特征,但miR-193a-3p是否参与调控RSF1尚没有文献报道。长链非编码RNA(lncRNA)构成非蛋白质编码RNA的另外一大类分子,其大小一般超过200个核苷酸,研究鉴定发现了大约7,000-23,000个lncRNAs。在细胞质中,lncRNA可以调节mRNA的稳定性和翻译,充当微小RNA(miRNA)的前体,或竞争内源RNA(ceRNA),调节miRNA。在细胞核中,lncRNA可以通过与启动子处的转录前启动复合物相互作用而在表观遗传水平和遗传水平上起作用。随着lncRNA研究的不断深入,研究人员在逐渐认识到lncRNA在肿瘤的诊治中可能具有重大潜力。在癌症组织中lncRNA往往表现出异常表达,这在癌症诊断中具有重要的意义,特别是在体积较小的肿瘤的早期在诊断方面,临床通过检测患者血液中的lncRNA表达水平的检测,对疾病进行早期诊断。在肿瘤治疗中lncRNA同样发挥了重要的作用,通过lncRNA在发病机制中作用的研究,为临床寻找更精确有效的治疗靶点和策略。最近几年有关lncRNA在骨肉瘤中的研究越来越多。研究发现,长链非编码RNA DNACR的表达在骨肉瘤组织标本和骨肉瘤细胞系中明显增高,并且DNACR高表达与骨肉瘤患者临床预后不良密切相关。细胞功能学实验表明,低表达DNACR能够抑制ROCK1介导的骨肉瘤细胞的增殖和转移能力。在lncRNA家族中XIST占据重要的位置,但是其在骨肉瘤的发生发展中的作用还不明确。lncRNA XIST(X-无活性特异性转录物)是XIST基因的主要调节因子的产物。研究显示,lncRNA XIST在细胞增殖,分化和基因组维持中起着关键作用。XIST靶向miR-92b抑制肝癌细胞的增殖和转移,揭示了XIST/miR-92b/Smad7信号轴在肝癌发生发展中的重要性,提示XIST可以作为肝癌的临床诊断和治疗的重要生物标志物。XIST和AR在膀胱癌组织中上调并且呈正相关。较高的XIST和AR表达与较差的膀胱癌TNM分期有关。降低XIST抑制膀胱癌细胞的增殖,侵袭和迁移能力,并且这种抑制作用可以通过AR过表达部分恢复。揭示了XIST/miR-124/AR调节轴在膀胱癌细胞生长,侵袭和迁移过程中发挥的重要作用。为明确RSF1在骨肉瘤发生发展中的作用,我们进行了三部分实验:第一、研究RSF1在骨肉瘤中的表达情况并对其临床资料进行分析。第二、在骨肉瘤细胞中干扰RSF1表达研究其生物学功能以及可能的通路。第三、研究RSF1的上游调控通路,确定调控轴。第一部分RSF1在骨肉瘤中的表达目的RSF1是ATP依赖的染色体重塑因子。有报导显示,RSF1的失调与肿瘤的进展密切相关。然而,RSF1在骨肉瘤中的作用至今尚未明确。本课题检测了41例骨肉瘤标本中RSF1的表达,探索其在骨肉瘤中的可能作用。方法收集41例骨肉瘤患者的临床标本,用免疫组织化学检测骨肉瘤样本中RSF1的蛋白表达。使用RT-定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测RSF1的mRNA在骨肉瘤组织中的表达。使用Kaplan-Meier分析检查肿瘤样品中RSF1表达水平与患者生存期之间的关系。进一步通过qRT-PCR检测RSF1的mRNA在骨肉瘤细胞中的表达情况,同时使用Western blot检测RSF1的蛋白质在骨肉瘤细胞中的表达情况。结果骨肉瘤标本中RSF1的蛋白表达水平明显高于健康对照组,同时骨肉瘤样品中RSF1的mRNA表达水平也明显高于健康对照组。相关性分析提示骨肉瘤中RSF1的高表达与骨肉瘤患者肿瘤的晚期临床分期和转移密切相关,但是同骨肉瘤患者的年龄,性别,肿瘤的大小,以及部位等没有显著相关性。Kaplan-Meier分析提示骨肉瘤患者中高RSF1表达同患者的低生存率正相关。除此之外qRT-PCR及Western blot结果显示,RSF1在骨肉瘤细胞中也明显高表达。结论本研究显示RSF1在骨肉瘤中高表达,同骨肉瘤患者的晚期临床分期,转移以及预后密切相关,提示RSF1在骨肉瘤的进展中具有重要作用,能够作为骨肉瘤潜在的新型预后生物标志物。第二部分RSF1表达在骨肉瘤生物学特性中的作用目的前期研究显示RSF1在骨肉瘤组织中高表达,且高表达同肿瘤晚期临床分期,转移及预后密切相关。然而,RSF1在骨肉瘤中的生物学功能仍不清楚。因此本章节着重研究RSF1在骨肉瘤细胞中的生物学作用。方法利用sh RNA敲弱Saos2和MG63骨肉瘤细胞中RSF1的表达。使用MTT实验,克隆形成实验,流式细胞仪,划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测RSF1对骨肉瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响。Western blot检测RSF1对骨肉瘤细胞MAPK/ERK信号通路的影响。进一步,通过裸鼠模型研究RSF1在小鼠体内的作用情况。结果在本研究中,我们成功构建了干扰RNA,并且有效的抑制了Saos2和MG63细胞中RSF1的表达。MTT实验结果显示,降低骨肉瘤细胞中RSF1表达可以明显抑制细胞的增殖能力。克隆形成实验也显示了类似的结果。进一步流式细胞学技术显示,降低骨肉瘤细胞中的RSF1表达,能够将骨肉瘤细胞阻滞在G0/G1期,同时促进骨肉瘤细胞的凋亡。进一步的划痕实验和Transwell侵袭实验显示,降低骨肉瘤细胞中RSF1表达可以明显抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。机制研究提示,降低骨肉瘤细胞中的RSF1表达,能够明显抑制骨肉瘤细胞中磷酸化的ERK1/2、p38和MEK,提示低表达RSF1能够抑制MAPK/ERK通路来从而调节骨肉瘤细胞的生长和转移。裸鼠体内试验结果显示,降低RSF1的表达能够明显抑制骨肉瘤细胞在体内生长。结论RSF1能够通过诱导和激活MAPK/ERK信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖,侵袭和转移。提示RSF1是骨肉瘤发展中的重要分子,并为以后的研究提出了新的治疗思路。第三部分XIST/miR-193a-3p靶向调节骨肉瘤细胞RSF1表达目的非编码RNA在肿瘤的发生和转移过程中具有重要作用,寻找可能调控RSF1的miRNA以及可能调控miRNA的lncRNA基因,使整个调控机制更为明确,寻找一个从lncRNA到miRNA再到靶基因的调控轴,为骨肉瘤将来的靶向治疗提供新的理论和实验依据。方法通过数据库检索和荧光素酶报告实验找到RSF1的上游miRNA,并用qRT-PCR和Western blot检测骨肉瘤细胞中miRNA对RSF1表达的影响;通过qRT-PCR检测miRNA在骨肉瘤组织中的表达情况,使用Kaplan-Meier分析miRNA的表达水平与患者生存期之间的关系,并将miRNA与RSF1的表达量做相关性分析,确定两者的靶向关系。进一步通过生物信息学分析,拉下实验以及荧光素酶报告实验找到能与miRNA结合的lncRNA,并确定两者的靶向关系。最后通过恢复实验敲弱骨肉瘤细胞中的lncRNA,研究其依赖于miRNA对RSF1的调控作用。结果通过公共数据库(Target Scan,micro RNA,miRDB)检索提示miR-193a-3p在RSF1m RNA的3’-UTR区域有一个结合位点,荧光素酶报告实验显示miR-193a-3p可与RSF1结合并抑制其表达,qRT-PCR和Western blot实验进一步确认了miR-193a-3p可靶向抑制RSF1的表达。进一步研究显示miR-193a-3p在骨肉瘤组织中低表达并与骨肉瘤患者肿瘤的晚期分期和转移密切相关,并且生存期明显降低,相关性分析也显示在骨肉瘤组织中miR-193a-3p与RSF1的表达呈负相关。进一步通过检索数据库找到能与miR-193a-3p结合的lncRNA XIST,通过拉下实验和荧光素酶报告实验证实XIST同miR-193a-3p的靶向关系,恢复实验显示XIST能够通过抑制miR-193a-3p达到对RSF1的正性调控作用,从而证实XIST在调节骨肉瘤细胞中起到ce RNA的作用。结论我们研究表明在骨肉瘤中XIST可能作为一种癌基因,负向调控miR-193a-3p的表达水平,进而减弱了其对RSF1表达的负向调控,从而使得RSF1表达增高。XIST/miR-193a-3p/RSF1轴提供了对骨肉瘤致癌作用分子机制的新见解,为未来骨肉瘤的治疗提供了新的方向。