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研究目的：
通过剖析 2014 年~2018 年全球 H9N2 基因进化特征，及时了解全球 H9N2基因变异及流行趋势，为禽流感防控提供详实可靠的信息依据；通过杂交瘤技术制备H9N2单克隆抗体，初步探索其特异性、交叉结合性及中和活性，为H9N2禽流感病毒导向治疗及快速检测提供新方向。
研究方法：
1.基因进化分析：检索GISAID和NCBI流感病毒数据库下载2014年~2018年H9N2病毒NA基因序列；应用BEAST软件构建进化树，分析基因进化速率、共同祖先及主要流行分支；通过构建Asymmetric模型计算NA基因在不同区域间的迁移速率、贝叶斯因子、后验概率及马尔可夫跳跃计数，展现基因动态迁移路径；采用MEGA软件分析序列同源性、抗原位点、唾液酸结合位点和酶活性位点变化；通过Data monkey在线软件构建SLAC和FEL模型进行基因选择压力分析，预测H9N2病毒流行趋势。
2.抗体制备及探索：采用纯化的H9N2全病毒免疫小鼠，经4次免疫后取效价较高的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，利用亚克隆技术筛选针对HA/NA的单克隆抗体；通过间接 ELISA 分析抗体交叉结合性及特异性；采用细胞实验对抗体中和活性进行初步探索。
研究结果：
1.本研究共获得432条全球2014年~2018年H9N2病毒NA序列，基因进化速率为 4.12×10-3次/位点/年(95%HPD:3.73×10-3~4.52×10-3)，tMRCA 为 1983 年(95%HPD:1980~1987)；核苷酸同源性为 74.68%~99.93%，氨基酸同源性为79.56%~99.93%；其中东亚国家核苷酸及氨基酸同源性最低（核苷酸77.73%~99.93%、氨基酸79.16%~99.93%）。
2.系统进化分析显示，全球2014年~2018年H9N2禽流感病毒NA基因可分为北美谱系和欧亚谱系，欧亚谱系又可分为Korea-like分支、G1分支、G9分支和Y280分支，其中以G1和Y280为主要流行分支；在国家分布中，中国、日本、俄罗斯和越南分离的NA基因散在分布于各分支，且存在不同程度的突变。
3.动态迁移分析显示，NA基因在全球传播进程中存在两条决定性迁移路线，分别为中国至东亚以及中国至东南亚(BF≥1000)；其次，中国至南亚和东南亚至东亚的迁移路线发挥了重要作用(100≤BF<1000)。整体而言，NA基因频繁从中国迁移到其他区域，鲜有出现 NA 基因从欧洲和美洲向其他国家迁移扩散的迹象。
4.基因分子特征显示，全球NA茎部38～39和63~65位点缺失分别为0.46%（2/432）和56.25%（243/432），其中中国（229/243）比其他国家更易发生63~65位点缺失；抗原位点中，153、328、331、346位点处氨基酸最为活跃，其中以中国抗原位点变异最为显著，其次为非洲和欧洲国家；唾液酸结合位点中，367~369、399~401和432~433位点较为活跃，其中以中国唾液酸结合位点变异最为显著，其次为东亚国家；酶活性位点中，并未发现文献报道的相关神经氨酸酶耐药位点突变；糖基化位点中，264位点处的糖基化位点完全缺失，44、61、69、365、402位点处的糖基化位点存在较大变异。
5.基因选择压力显示，全球NA序列在SLAC模型中存在3、8、19、62、77、86、93和312正向选择位点（P<0.1），FEL模型中存在3、8、9和19正向选择位点（P<0.1）。
6.本研究成功制备了9株NA（1E4-E11、6A9-F10、6C2-C11、6G11-C8、7F5-A7、8C1-D4、9G12-1C4、19C2、21E10）和4株HA（1B5-D11、7D5-F6、13E10-G8、13H7-G12）单克隆抗体，其中7D5-F6抗体效价最高（1×10-6），1E4-E11、8C1-D11抗体效价最低（1×10-3），其余抗体效价均在1×10-5~1×10-4。
7.抗体特异性结果显示，存在4株NA抗体（7F5-A7、9G12-1C4、19C2、21E10）可与不同年份的H9N2分离株结合；交叉结合性结果显示，4株HA和9株NA抗体均不与H1N2、H3N2、H5N8、H6N6和H7N9结合。
8.抗体中和实验结果显示，H9N2病毒TCID50为10-5.857，存在2株HA（1B5-D11、13H7-G12）和1株NA（9G12-1C4）抗体具有中和保护活性，PD50分别为2-8.833、2-8.167和2-7.833。
研究结论：
1.全球2014年~2018年H9N2病毒NA基因进化速率存在加快趋势，其中以Y280和G1为主要流行分支；在全球NA基因传播过程中，中国至东亚以及中国至东南亚为重要迁移路径，各国需加强禽流感国际防控合作机制，以防止H9N2禽流感病毒进一步在国家间传播扩散。
2.全球2014年~2018年H9N2病毒NA基因酶活性位点相对稳定，但茎部区域存在缺失，抗原位点、唾液酸结合位点、糖基化位点存在不同程度的变异，正向选择压力位点不断出现，建议重点加强上述突变位点的实时监测。
3.在小鼠单克隆抗体制备中，采用纯化的H9N2活病毒免疫小鼠，保证了抗原纯度及完整空间结构，对于成功制备流感单克隆抗体具有重要意义。所制备的的2株HA和1株NA单克隆抗体存在细胞中和保护活性，未来可进一步寻找关键抗原区域并进行人源化改造，对于H9N2导向治疗具有重要意义。
4.本研究制备的4株NA单克隆抗体可与不同年份H9N2结合，与其他亚型流感病毒不存在交叉结合性，今后可进一步用于N2特异性检测试剂盒开发，为禽流感快速检测提供了新思路。
通过剖析 2014 年~2018 年全球 H9N2 基因进化特征，及时了解全球 H9N2基因变异及流行趋势，为禽流感防控提供详实可靠的信息依据；通过杂交瘤技术制备H9N2单克隆抗体，初步探索其特异性、交叉结合性及中和活性，为H9N2禽流感病毒导向治疗及快速检测提供新方向。
研究方法：
1.基因进化分析：检索GISAID和NCBI流感病毒数据库下载2014年~2018年H9N2病毒NA基因序列；应用BEAST软件构建进化树，分析基因进化速率、共同祖先及主要流行分支；通过构建Asymmetric模型计算NA基因在不同区域间的迁移速率、贝叶斯因子、后验概率及马尔可夫跳跃计数，展现基因动态迁移路径；采用MEGA软件分析序列同源性、抗原位点、唾液酸结合位点和酶活性位点变化；通过Data monkey在线软件构建SLAC和FEL模型进行基因选择压力分析，预测H9N2病毒流行趋势。
2.抗体制备及探索：采用纯化的H9N2全病毒免疫小鼠，经4次免疫后取效价较高的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，利用亚克隆技术筛选针对HA/NA的单克隆抗体；通过间接 ELISA 分析抗体交叉结合性及特异性；采用细胞实验对抗体中和活性进行初步探索。
研究结果：
1.本研究共获得432条全球2014年~2018年H9N2病毒NA序列，基因进化速率为 4.12×10-3次/位点/年(95%HPD:3.73×10-3~4.52×10-3)，tMRCA 为 1983 年(95%HPD:1980~1987)；核苷酸同源性为 74.68%~99.93%，氨基酸同源性为79.56%~99.93%；其中东亚国家核苷酸及氨基酸同源性最低（核苷酸77.73%~99.93%、氨基酸79.16%~99.93%）。
2.系统进化分析显示，全球2014年~2018年H9N2禽流感病毒NA基因可分为北美谱系和欧亚谱系，欧亚谱系又可分为Korea-like分支、G1分支、G9分支和Y280分支，其中以G1和Y280为主要流行分支；在国家分布中，中国、日本、俄罗斯和越南分离的NA基因散在分布于各分支，且存在不同程度的突变。
3.动态迁移分析显示，NA基因在全球传播进程中存在两条决定性迁移路线，分别为中国至东亚以及中国至东南亚(BF≥1000)；其次，中国至南亚和东南亚至东亚的迁移路线发挥了重要作用(100≤BF<1000)。整体而言，NA基因频繁从中国迁移到其他区域，鲜有出现 NA 基因从欧洲和美洲向其他国家迁移扩散的迹象。
4.基因分子特征显示，全球NA茎部38～39和63~65位点缺失分别为0.46%（2/432）和56.25%（243/432），其中中国（229/243）比其他国家更易发生63~65位点缺失；抗原位点中，153、328、331、346位点处氨基酸最为活跃，其中以中国抗原位点变异最为显著，其次为非洲和欧洲国家；唾液酸结合位点中，367~369、399~401和432~433位点较为活跃，其中以中国唾液酸结合位点变异最为显著，其次为东亚国家；酶活性位点中，并未发现文献报道的相关神经氨酸酶耐药位点突变；糖基化位点中，264位点处的糖基化位点完全缺失，44、61、69、365、402位点处的糖基化位点存在较大变异。
5.基因选择压力显示，全球NA序列在SLAC模型中存在3、8、19、62、77、86、93和312正向选择位点（P<0.1），FEL模型中存在3、8、9和19正向选择位点（P<0.1）。
6.本研究成功制备了9株NA（1E4-E11、6A9-F10、6C2-C11、6G11-C8、7F5-A7、8C1-D4、9G12-1C4、19C2、21E10）和4株HA（1B5-D11、7D5-F6、13E10-G8、13H7-G12）单克隆抗体，其中7D5-F6抗体效价最高（1×10-6），1E4-E11、8C1-D11抗体效价最低（1×10-3），其余抗体效价均在1×10-5~1×10-4。
7.抗体特异性结果显示，存在4株NA抗体（7F5-A7、9G12-1C4、19C2、21E10）可与不同年份的H9N2分离株结合；交叉结合性结果显示，4株HA和9株NA抗体均不与H1N2、H3N2、H5N8、H6N6和H7N9结合。
8.抗体中和实验结果显示，H9N2病毒TCID50为10-5.857，存在2株HA（1B5-D11、13H7-G12）和1株NA（9G12-1C4）抗体具有中和保护活性，PD50分别为2-8.833、2-8.167和2-7.833。
研究结论：
1.全球2014年~2018年H9N2病毒NA基因进化速率存在加快趋势，其中以Y280和G1为主要流行分支；在全球NA基因传播过程中，中国至东亚以及中国至东南亚为重要迁移路径，各国需加强禽流感国际防控合作机制，以防止H9N2禽流感病毒进一步在国家间传播扩散。
2.全球2014年~2018年H9N2病毒NA基因酶活性位点相对稳定，但茎部区域存在缺失，抗原位点、唾液酸结合位点、糖基化位点存在不同程度的变异，正向选择压力位点不断出现，建议重点加强上述突变位点的实时监测。
3.在小鼠单克隆抗体制备中，采用纯化的H9N2活病毒免疫小鼠，保证了抗原纯度及完整空间结构，对于成功制备流感单克隆抗体具有重要意义。所制备的的2株HA和1株NA单克隆抗体存在细胞中和保护活性，未来可进一步寻找关键抗原区域并进行人源化改造，对于H9N2导向治疗具有重要意义。
4.本研究制备的4株NA单克隆抗体可与不同年份H9N2结合，与其他亚型流感病毒不存在交叉结合性，今后可进一步用于N2特异性检测试剂盒开发，为禽流感快速检测提供了新思路。