论文部分内容阅读
异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是银鲫卵子与异源精子所产的后代。江苏省扬州地区是生产异育银鲫鱼苗鱼种的主要地区之一,每年为异育银鲫成鱼养殖地区提供大量的鱼苗和鱼种。异育银鲫繁殖期为每年的4月下旬至5月中旬,近几年的6月上旬左右起,该地区培育过程中的异育银鲫鱼苗体表会出现一种由粘孢子虫寄生而出现孢囊的疾病,发病使得鱼体变形、消瘦、游动困难,严重时导致鱼苗大量死亡,累积死亡率约在10%-60%,鱼苗死亡以及病鱼销售困难给鱼苗养殖户带来巨大的经济损失。因此有必要开展该病的病原和病理研究,为进一步的研究和防治该病的发生提供基础。为了确定粘孢子虫在何种条件下进行形态学观察和测量时最精确,本文以引起该粘孢子虫病的病原粘孢子虫作为样本,将其新鲜成熟孢子用生理盐水制成的水浸片作为对照组,将蒸馏水制成的新鲜孢子水浸片,中性甲醛、70%酒精、95%酒精、Bouin’s液、2.5%戊二醛、A.F.F液和G.A.F液保存24小时后孢子的孢子长、宽、厚、极囊长和宽的测量数据分别与对照组进行统计学分析,结果表明,蒸馏水对孢子的形态略微膨胀,但影响不大;所有的固定液均会对孢子的形态产生影响,中性甲醛、酒精、Bouin’s液和2.5%戊二醛会使孢子产生一定收缩,95%酒精使孢子收缩最严重,70%酒精和Bouin’s液次之;2.5%戊二醛对于保存后的粘孢子虫的形态影响最小,最适于保存孢子;中性甲醛对孢子形态的影响稍大于2.5%戊二醛,但在没有条件使用2.5%戊二醛时,也可用中性甲醛替代。在确定了鉴定方法后,通过光镜、扫描电镜和18S rDNA序列对比,确定该病原粘孢子虫为武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis),并对其进行了形态学重描述和系统发育分析。成熟孢子壳面观为瓜子状,前端狭窄而尖锐,后部钝圆,两片壳瓣前端形状不对称,其中一个壳瓣前端有乳头状突起,缝面观为厚梭形,缝脊直,孢子壳瓣底部内侧有1-4个“V”形褶皱,部分孢子后部包围有膜状鞘,膜状鞘两侧起始的位置不同,离孢子前端的垂直距离为5.03-16.69(10.37±2.36)μm。极囊1个,近似球形,位于孢子前端,极丝7-10圈。2个圆形或近三角形的极囊核,分别位于极囊后部左右两侧。Lugol’s碘液染色后嗜碘泡呈棕黄色,形状为圆形或椭圆形。孢子的测量结果:孢子长21.92-26.93(24.55±0.95)μm,孢子宽11.43-15.48(13.72±0.98)μm,孢子厚10.83-14.14(11.80±0.45)μm;极囊长9.64-12.79(11.54±0.68)μm,极囊宽8.14-10.28(9.12±0.45)μm,极丝长158.49-179.22(170.71±5.67)μm(n=20),膜状鞘外表面距孢子壳瓣表面最远距离为1.73-4.39(2.73±0.60)μm。亚甲基蓝染色表明极丝为中空管状。获得了部分18S rDNA序列,GenBank登录号为JQ088179,经18S rDNA序列分析对比,与已报道的T. wuhanensis[HQ613410]和[AY165181]相似度分别为99.87%和97.36%。本文依据形态学以及18S rDNA序列信息确定了该孢子虫的分类地位。系统发育分析显示,单极虫与碘泡虫具有非常近的亲缘关系,将单极虫属与碘泡虫属二者归属于碘泡科的分类方法更合理。5月下旬至6月中旬为发病初期,此时孢囊很小,仅导致皮肤微微隆起。随后孢囊开始增大,表面分布有少量黑色斑点。孢囊为椭圆形,位于皮肤真皮层的疏松结缔组织中,孢囊周围的疏松结缔组织增生,其中可见较多的黑色素细胞。孢囊膜为由结缔组织形成的非细胞结构。早期时,产孢体多位于孢囊膜附近,随着发展,产孢体进入孢囊内,位于内部的产孢体会比孢囊膜附近的产孢体更早地形成成熟孢子。成熟孢子由双产孢体或四核产孢体发育形成。7月中下旬至8月中旬为发病高峰期,此时孢囊饱满,表面有大而密集的黑色斑点,孢囊直径最大超过1.7mm,孢囊数最多可达30个以上。除皮肤和鳍外,其它组织器官未发现孢囊和孢子。较大的孢囊导致鳞片弯曲,有的孢囊也会受鳞片挤压而变形。有时两个孢囊相互靠近而融合。孢囊周围增生的疏松结缔组织中存在毛细血管增生现象。黑色素细胞较初期更多。孢囊附近存在一种未知的团状物。孢囊内存在大量成熟孢子,但孢囊膜附近仍存在产孢体。约8月中旬开始疾病进入消退期,孢囊开始逐渐萎缩、消失。此时孢囊周围存在较之前更多更密集的黑色素细胞,导致孢囊表面颜色变黑。孢囊中只有成熟孢子。随着疾病消退,孢囊膜消失,由上皮细胞取而代之。到消退晚期,上皮细胞膜出现缺口,孢子从缺口中流出。孢子消失后,孢囊仍然会存在一段时间。孢囊消失后,增生的结缔组织、黑色素细胞以及未知团状物仍存在。消退后,结缔组织中仍可见游离孢子。到9月上中旬,孢囊消失,但尚可见病灶迹痕。