黑羽番鸭是一种肉品质好且蛋白含量高的优良肉鸭品种,但其由于受野性的影响,常出现抱窝现象造成产蛋性能低下,整个繁殖期的产蛋量约为155个左右。黑番鸭由于其自然野性的存在导致就巢性很强,而就巢性强就会导致番鸭产生抱窝行为,从而造成卵泡闭锁进而使得鸭子的产蛋性能逐渐下降,这就严重的影响了番鸭养殖业的发展。因此,提高黑番鸭产蛋性能是促进番鸭养殖业发展的一个重点。本研究通过对黑番鸭开产前、产蛋高峰期及高产期的低产鸭的卵巢进行转录组测序,旨在探究影响黑羽番鸭产蛋性能的相关基因。通过分析转录组测序结果筛选出差异表达的基因,对筛选的部分基因进行组织特异性表达和不同等级卵泡表达谱的研究,从而进一步确定影响卵巢发育的关键基因,最后根据组织表达和卵泡表达的结果,选择其中一个基因进行后续的克隆及功能分析的试验研究。本文主要研究内容及结果:1.黑羽番鸭卵巢转录组差异基因筛选通过分析黑番鸭三个产蛋期的卵巢测序结果,结合基因的GO富集和KEGG通路分析产蛋相关的通路,三个时期的数据共可以分成两组进行比较,分别是开产前和高产期进行比较,共发现3020个DEGs,其中上调基因1019个,下调基因2001个;另一组则是高产期的高产组和低产组的比较,共发现176个DEGs,其中上调基因51个,下调基因125个。2.卵巢发育相关基因的组织特异性表达及不同等级卵泡的表达规律从众多的DEGs中选择了差异表达较高的FBXO5、ZP4和TGFβ3进行了黑番鸭组织特异性表达鉴定和卵巢不同等级卵泡的表达谱研究。通过RT-q PCR技术检测这三个基因在卵巢、心、肝、脾、肺、肾、胃、胸肌等8个组织表达水平,结果显示这三个基因在各个组织中均有表达,且在卵巢中的相对表达量显著高于其他6个组织,从而再次成功验证了所选基因是对卵巢发育有影响的基因;采用RT-q PCR技术检测基因在不同等级卵泡中的表达水平:FBXO5基因在等级前卵泡中的表达情况为,在超过8 mm大小的大黄卵泡时期的表达量最高,远高于等级前卵泡的其他三个时期,其他三个时期之间的表达量差异不显著,但是随着卵泡发育变大,表达量有上涨的趋势;ZP4基因在小白卵泡时期表达量最高,随着卵泡发育变大表达量也随之减少,到大黄卵泡时期该基因已几乎不表达了;TGFβ3基因在四个时期都有表达,随着卵泡发育,该基因的表达量渐下降,且每个时期之间的表达量的都差异显著。根据定量结果和文献阅读,可以初步推断所选三个基因的功能,也为后续的研究提供了基础的知识。3.FBXO5的克隆及生物信息学分析从三个基因中选择了FBXO5,根据转录组测序得到FBXO5基因的全长序列,成功克隆了FBXO5的全长CDS区并对该基因进行了简单的生物信息学分析,通过克隆得到FBXO5的CDS区全长为1278 bp,共编码氨基酸421个。经过蛋白的亲疏水性分析,了解到该基因的蛋白是亲水性蛋白,且该基因不能把新合成的蛋白引向分泌通路;在预测该基因蛋白二级结构时得到占比最高的二级结构是无规卷曲,占比最低的二级结构是β-转角,并且还成功建立了该蛋白的三维结构图。4.黑番鸭FBXO5基因功能鉴定在成功构建FBXO5克隆载体的基础上成功构建了过表达载体,且成功分离培养了番鸭的卵巢颗粒细胞,并在原代颗粒细胞水平上成功验证了FBXO5的功能。通过q PCR检测FBXO5基因过表达后细胞凋亡和增殖相关标志基因的相对表达量。由结果可知,FBXO5基因过表达后,处理组中挑选的促凋亡标志基因BAX和MYC的表达量相比对照组,都有明显的下降,抗凋亡标志基因BCL-2相比对照组来说表达量则有一定的上升,由此可以说明FBXO5基因不会促进细胞的凋亡;增殖标志基因PCNA和CDK2在处理组中的表达量显著高于对照组,由此可以说明FBXO5可以促进细胞增殖。通过WB技术也成功验证了构建的FBXO5表达载体可以在细胞水平上成功翻译成蛋白。综上,本试验在基于黑羽番鸭卵巢转录组测序的结果上,成功筛选出与卵巢发育相关的DEGs,并初步探究了FBXO5基因对卵泡颗粒细胞起增殖的影响,该研究对于黑番鸭产蛋性能方面的研究有着较为重要的意义。