跨损伤DNA合成通路基因REV3L在宫颈癌细胞化疗增敏中的作用及其机制研究

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目的REV3L是DNA聚合酶ζ(Polζ)的催化亚基,在跨损伤DNA合成通路(TLS)中起关键作用。本课题旨在研究REV3L基因对宫颈癌细胞化疗敏感性的影响,探讨REV3L基因在宫颈癌中作为分子靶点的价值。方法采用免疫组化法检测123例宫颈癌组织及17例正常宫颈组织中Polζ蛋白的表达水平。构建REV3L基因过表达载体pcDNA-REV3L后导入REV3L低表达的宫颈癌细胞系,构建REV3L基因干扰载体shRNA-REV3L并转染REV3L高表达宫颈癌细胞系后,通过CCK-8法检测对细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期变化、平板克隆形成实验检测克隆形成率的变化,进一步通过CCK-8法检测REV3L基因对铂类药物耐受性的影响,通过流式细胞术检测药物作用后细胞凋亡情况,并通过蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xl及Bax等的变化情况。通过免疫荧光法检测顺铂处理后REV3L基因对Y-H2AX焦点形成情况的影响,蛋白免疫印迹法检测Y-H2AX等蛋白的变化。结果宫颈癌组织中Polζ蛋白表达水平较正常宫颈组织高(P<0.05)。REV3L基因沉默后宫颈癌细胞株增殖减慢,REV3L基因过表达后宫颈癌细胞株增殖加快:沉默REV3L基因通过G1/S期阻滞抑制细胞周期进展,而REV3L基因过表达后可以越过G1/S期细胞周期检查点促进细胞周期进展;REV3L基因沉默后细胞平板克隆形成率减少,而过表达后细胞克隆形成率增加。下调宫颈癌细胞系REV3L基因表达后CCK-8检测示宫颈癌细胞对顺铂的敏感性增加;流式细胞仪检测顺铂作用后早期凋亡率增加;Western blot检测促凋亡蛋白升高,而抗凋亡蛋白降低;免疫荧光检测细胞内Y-H2AX焦点形成增多,Western blot检测Y-H2AX蛋白表达升高。REV3L基因过表达后CCK-8示细胞对顺铂的抵抗性增加;流式细胞仪检测顺铂作用后早期凋亡率降低;Western blot检测促凋亡蛋白降低,而抗凋亡蛋白升高;免疫荧光检测细胞内Y-H2AX焦点形成减少,Western blot检测Y-H2AX蛋白表达降低。结论抑制REV3L基因在宫颈癌细胞中的表达,可提高细胞对顺铂的敏感性,而过表达REV3L基因增加其对顺铂的抵抗性。REV3L可能作为宫颈癌化疗增敏的分子靶点。
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