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研究背景和研究目的近年来,大麻素系统在调节炎症和疼痛反应中的作用引起了广泛研究。大麻素主要通过大麻素受体1和2(CB1和CB2)发挥作用,它们均属于G蛋白偶联受体家族。研究表明,CB2在中枢神经系统和周围组织的早期炎症反应中起重要作用。许多证据表明了 CB2参与免疫调节,CB2在不同类型的白细胞中表达,介导了大麻素的抗炎作用和免疫调节作用。在人类,啮齿动物和猴子在内的多种物种的膀胱组织中均发现了 CB2,并且有多项研究表明CB2可以在膀胱中发挥作用。用选择性CB2激动剂治疗可部分恢复尿道梗阻模型大鼠的膀胱功能,使得大鼠的膀胱容量增加,尿道梗阻症状减轻,排尿间隔延长。大麻素受体2的激活显著降低了丙烯醛诱导的膀胱炎的严重程度。然而,CB2在间质性膀胱炎中的特定作用和下游信号传导途径仍然未知。间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)是一种病因和发病机制未明的慢性盆腔疼痛症状。IC/BPS的特征表现为整个骨盆区域的疼痛,压力或不适感,伴有尿频和尿急,并且排除泌尿系感染和其他病变。目前,影响IC/BPS发生的危险因素尚不明确。IC/BPS的诊断是根据临床症状和进行病因排除后进行的。鉴于与IC/BPS相关的患病率和医疗支出,制定减轻IC/PBS患者症状的治疗策略引起了广泛关注。自噬是将包括细胞器和大分子聚集体在内的细胞质成分输送到溶酶体进一步降解的过程。自噬体(双膜囊泡)将细胞质内的物质(例如细胞器和大分子聚集体)隔离包裹,然后与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体,利用溶酶体内的酶类进行大量降解。目前,已鉴定出30多种自噬相关(ATG)基因,其中研究最多的基因包括微管相关蛋白 1 轻链 3 beta(MAP1LC3B/LC3B),SQSTM1/p62,ATG5和BECN1/Beclin1。MAP1LC3B/LC3B是ATG8的哺乳动物直系同源物,在自噬小体的形成中起主要作用。因此,LC3B-Ⅱ的表达水平是监测哺乳动物细胞自噬过程的关键指标。自噬一直被认为是对营养缺乏的应激反应,可维持细胞能量平衡。最近多项研究表明自噬在多种人类炎症性疾病和自身免疫性疾病中起着重要的作用。然而,间质性膀胱炎是否受到自噬的调节以及CB2在膀胱炎发病过程中的作用是否与自噬相关仍然未知。在本研究中,我们探讨了 CB2激活在环磷酰胺(CYP)引起的膀胱炎中的保护作用,并研究了 CB2对抗环磷酰胺引起的膀胱损伤的潜在机制。研究方法本实验采用健康雌性C57BL/6J小鼠,10-12周龄,清洁级饲养,自由饮食。实验随机分组且每组至少6只小鼠。实验分组如下:(a)验证CYP诱导的膀胱炎小鼠中CB2的差异表达,将小鼠随机分成两组(每组n=12):对照组为用生理盐水处理的健康小鼠,CYP组为用CYP(150 mg/kg)处理的膀胱炎小鼠。CYP给药后二十四小时,每组6只动物用于膀胱称重,苏木素/伊红(H&E)染色或免疫组化染色。另外六只小鼠的膀胱组织用于免疫印迹分析和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。(b)为探讨CB2激活后对CYP处理的小鼠的疼痛敏感性和排尿行为的作用,将小鼠随机分成四组(每组n=10):对照组为生理盐水处理的小鼠;CYP组为CYP诱导的膀胱炎小鼠;CYP+AM-630组是在注射相同剂量的CYP之前用CB2拮抗剂AM-630(1mg/kg)处理的小鼠;CYP+JWH-133组是在注射相同剂量的CYP之前用CB2激动剂JWH-133(1 mg/kg)处理的小鼠。(c)评估CB2对CYP处理的小鼠的膀胱炎症和氧化应激反应的影响,将小鼠随机分为四组(每组n=12):对照组,CYP组,CYP+AM-630组和CYP+JWH-133组。每组六只动物用于测量氧化应激产物和抗氧化酶活性。另六只小鼠用于RNA分离和RT-PCR。(d)评估CB2对CYP处理小鼠的膀胱自噬和AMPK-mTOR途径的影响。将小鼠随机分为5组(每组n=12):对照组,CYP组,CYP+AM-630组,CYP+JWH-133组和CYP+JWH-133+3-MA(10mg/kg)组。每组六只动物用于免疫印迹分析,六只小鼠用于透射电子显微镜(TEM)测量。(e)验证自噬是否具有抗炎和抗氧化应激活性。小鼠随机分为5组(每组n=12):对照组,CYP 组,CYP+AM-630 组,CYP+JWH-133 组,CYP+JWH-133+3-MA组。每组6只动物被用来测量氧化产物和抗氧化酶活性。另取6只小鼠进行RNA分离和RT-PCR检测。研究结果(a)腹腔内注射CYP后24小时,经CYP处理的小鼠膀胱显示出组织学炎症迹象。在CYP处理的小鼠膀胱中,CB2的表达明显增加。(b)CYP处理的小鼠的疼痛敏感性显著提高,而CB2激动剂JWH-133减弱了这种作用(P<0.05)。CYP处理后,尿斑数量显著增加,而在JWH-133处理的小鼠中尿斑数量减少(P<0.05)。(c)用JWH-133激活CB2可显著减轻CYP诱导的膀胱组织炎症反应和氧化应激。(d)JWH-133对CB2的激活增加了膀胱炎小鼠膀胱中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达,并降低了 SQSTM1/p62的表达,而AM-630则产生了反作用。(e)JWH-133可以促进自噬,而3-MA则阻断JWH-133引起的自噬,进而消除了 CB2在减轻膀胱组织炎症反应和氧化应激损伤中的作用。此外,在膀胱炎模型中,用3-MA处理可降低由JWH-133导致的p-AMPK的表达并诱导mTOR磷酸化。研究结论本研究证实了 CB2的激活降低了 CYP诱导的膀胱炎症状的严重程度并减轻了膀胱炎症。CB2的激活可通过自噬的激活来保护膀胱,AMPK-mTOR途径可能参与自噬的启动。