动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是脂质和复合糖类积聚、出血和血栓形成、纤维组织增生和钙质沉着,并伴有动脉中膜改变的联合病变,它是危害人类健康最严重的心血管疾病。尽管许多基础及临床研究已证实AS是多因素多途径共同作用的结果,但AS发病机理至今尚未完全明确。本研究旨在阐明E-/B48脂蛋白诱导巨噬细胞转化为泡沫样细胞的信号转导途径与确切机制。应激被认为是心血管疾病发生的机理之一,内质网应激被发现参与AS的形成。内质网应激是一种由于内外环境变化而导致的错误折叠与未折叠蛋白质在内质网腔内聚集以及钙离子平衡紊乱的状态。研究发现,内质网应激参与从动脉内皮细胞功能障碍、泡沫样细胞形成到动脉粥样斑块破裂的每一个环节,表明内质网应激在AS的形成和发展中发挥着重要作用。在真核细胞中,内质网中未折叠蛋白聚集时,细胞为生存便会启动一系列适应性反应,我们称之为未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。UPR的主要效应之一是通过启动真核细胞翻译起始子2a (eukaryotic initiation factor-2α, eIF-2α)的磷酸化抑制(?)mRNAs的翻译,减轻细胞损伤。本室以前的研究表明,载脂蛋白E基因敲除但载脂蛋白B48过表达(E-/B48)的脂蛋白能够诱导巨噬细胞转化为泡沫样细胞,而E-/B48脂蛋白诱导的泡沫样细胞形成与核糖核酸依赖性蛋白激酶样内质网激酶(RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)-eIF2α-活化转录因子4(activating transcription factor-4, ATF4)通路的激活有关；我们还观察到,用eIF-2α磷酸化激酶抑制剂2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2-AP)能够抑制E-/B48脂蛋白诱导的泡沫样细胞形成。这些实验结果表明,E-/B48脂蛋白通过内质网应激和激活UPR诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞。由于2-AP是一个广谱的磷酸化激酶抑制剂,它不仅能抑制PERK的磷酸化,还能抑制丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)的磷酸化。因此,有必要求证E-/B48脂蛋白诱导巨噬细胞转化为泡沫样细胞的信号转导途径与确切机制。我们首先用优势负性突变(dominant negative mutant)抑制内源性PERK和eIF-2α的磷酸化,证实E-/B48脂蛋白选择性激活PERK,进而诱导eIF-2α的磷酸化；同时,还从胆固醇转运入手,证实胆固醇流出降低也是E-/B48脂蛋白诱导巨噬细胞转化为泡沫样细胞的机制之一。第一部分E-/B48脂蛋白在巨噬细胞内聚集及eIF-2α磷酸的作用Ⅰ. eIF2a-S51A突变体的建立及作用研究实验目的证实E-/B48脂蛋白诱导巨噬细胞泡沫样改变与eIF-2α磷酸化的关系实验方法构建eIF-2α非磷酸化突变体(eIF2α-S51A),将空载体与eIF2α-S51A分别转染细胞建立稳定转染细胞系,用E+/B48(含载脂蛋白E基因和载脂蛋白B48基因,阴性对照)脂蛋白、E-/B48脂蛋白和不加任何脂蛋白的培养基分别处理转染的细胞后,采用酶比色法检测细胞内游离胆固醇(free cholesterol, FC)和胆固醇酯(esterified cholesterol, EC)水平；用放免法检测E+/B48和E-/B48脂蛋白的代谢状况；用Western免疫印迹法检测参与脂蛋白的脂质成分和蛋白成分代谢的溶酶体水解酶的表达,以及eIF-2α的总体表达及磷酸化水平；用蔗糖梯度离心法分离细胞polysome,检测细胞mRNAs翻译状况；提取polysome mRNA,用实时定量PCR检测溶酶体水解酶和ATF4的翻译效率。实验结果1.不同处理因素,空载体转染组与eIF2α-S51A转染组细胞eIF-2α的磷酸化水平检测结果：无论是空载体转染组还是eIF2α-S51A转染组,E+/B48脂蛋白处理均未增加eIF-2α的磷酸化；与对照组及E+/B48脂蛋白处理组相比,E-/B48脂蛋白明显增强空载体转染组细胞的eIF-2α磷酸化及下游ATF4的蛋白表达,相反,E-/B48脂蛋白未增加eIF2α-S51A转染组细胞eIF-2α的磷酸化及下游ATF4的蛋白表达。2.细胞总体mRNA的翻译效率检测结果：在空载体转染组细胞,经E-/B48脂蛋白处理后,细胞总mRNA的翻译效率明显降低；当细胞过表达eIF2α-S51A时,E-/B48脂蛋白处理未能降低细胞总mRNA的翻译效率。3.空载体转染组与eIF2α-S51A转染组两组细胞,脂质代谢水平检测结果：在空载体转染组细胞,E-/B48脂蛋白处理后细胞内脂质的含量明显增加,并且细胞对E-/B48脂蛋白的降解随孵育时间延长降低；当细胞过表达eIF2α-S51A时,E-/B48脂蛋白处理后细胞内脂质的含量明显降低,而且随孵育时间延长,细胞对E-/B48脂蛋白的降解增加(与空载体转染、E-/B48脂蛋白处理组相比)；相反,无论是空载体转染组还是eIF2α-S51A转染组,E+/1B48脂蛋白处理后均既未明显增加细胞内脂质含量,亦未明显降低细胞对E+/B48脂蛋白的降解。无论是空载体转染组还是eIF2α-S51A转染组,各组细胞表面结合E+/B48和E-/B48脂蛋白的能力无明显差异,而且各组细胞摄取E+/B48和E-/B48脂蛋白的总量亦无显著差异。4.空载体转染组与eIF2α-S51A转染组两组细胞,胞内溶酶体酸酶(lysosomal acid lipase, LAL)与组织蛋白酶B (cathepsin B, Cath B)的翻译效率以及蛋白表达水平检测：在空载体转染组细胞,E-/B48脂蛋白处理后LAL和Cath B的翻译效率和蛋白表达水平明显降低；当细胞过表达eIF2α-S51A时,E-/B48脂蛋白诱导的降低效应被逆转；相反,无论是空载体转染组还是eIF2α-S51A转染组,细胞经E+/B48脂蛋白处理后,LAL和Cath B的翻译效率和蛋白表达水平均未发生变化。实验结论1.eIF2α-S51A能够抑制E-/B48脂蛋白诱导的内源性eIF-2α磷酸化；2.E-/B48脂蛋白抑制细胞总体(?)nRNA翻译效率,抑制eIF-2α磷酸化能够逆转E-/B48脂蛋白所致的降低效应；3.细胞内脂质含量的增加与细胞对E-/B48脂蛋白降解的降低及LAL和Cath B的翻译效率及蛋白表达水平降低有关,而LAL和Cath B的翻译效率及蛋白表达降低与eIF-2α的磷酸化增加有关；4.抑制eIF-2α的磷酸化能够增加LAL和Cath B的翻译效率及蛋白表达水平,进而增加细胞对脂质降解,减少E-/B48脂蛋白在细胞内的聚集。Ⅱ. PERK介导E-/B48脂蛋白诱导的eIF-2α磷酸化实验目的探讨E-/B48脂蛋白是否通过选择性增加PERK的磷酸化,进而诱导eIF-2α的磷酸化及泡沫细胞的形成。实验方法构建PERK非磷酸化突变体(PERK-K618A),用E+/B48脂蛋白、E-/B48脂蛋白和不加任何脂蛋白的培养基分别处理转染的细胞后,采用酶比色法检测细胞内FC和EC水平,用Western免疫印迹检测eIF-2α及eIF-2α蛋白激酶的总体表达及磷酸化水平。实验结果1.eIF-2α蛋白激酶水平检测：与对照组相比,E+/B48脂蛋白处理后PER、PKR及GCN2的总体表达水平及磷酸化水平均无明显变化；与对照组相比,E-/B48脂蛋白处理后PERK的磷酸化水平明显增加,但是PKR及GCN2的磷酸化水平无明显变化。2.不同处理因素,空载体转染组与PERK-K618A转染组细胞PERK及eIF-2α的磷酸化水平检测结果：无论是空载体转染组还是PERK-K618A转染组,E+/B48脂蛋白处理均未增加PERK和eIF-2α的磷酸化；与对照组及E+/B48脂蛋白处理组相比,E-/B48脂蛋白明显增强空载体转染组细胞的PERK和eIF-2α磷酸化,相反,E-/B48脂蛋白未增加PERK-K618A转染组细胞PERK和eIF-2α的磷酸化。3.空载体转染组与PERK-K618A转染组两组细胞,脂质代谢水平检测结果：在空载体转染组细胞,E-/B48脂蛋白处理后细胞内脂质的含量明显增加；当细胞过表达PERK-K618A时,E-/B48脂蛋白处理后细胞内脂质的含量明显降低(与空载体转染、E-/B48脂蛋白处理组相比)；相反,无论是空载体转染组还是PERK-K618A转染组,E+/B48脂蛋白处理后均未明显增加细胞内脂质含量。实验结论1.E-/B48脂蛋白选择性增加PERK磷酸化；2. PERK-K618A能够抑制E-/B48脂蛋白诱导的内源性PERK磷酸化；3.抑制PERK磷酸化,能够抑制eIF-2α的磷酸化及细胞内脂质的聚集。我们的研究表明,内质网应激在E-/B48脂蛋白诱导泡沫细胞形成中发挥了重要作用。E-/B48脂蛋白通过激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路,降低脂质和溶酶体水解酶的合成,抑制脂质的降解,从而引起脂质在巨噬细胞内的聚集,导致巨噬细胞发生泡沫样化改变。第二部分eIF-2a磷酸化在ABC转运体介导的胆固醇流出中的作用胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)是机体周围组织细胞胆固醇转运至肝脏转化、清除的重要生理过程,它在维持机体胆固醇代谢平衡和AS发生及发展过程中起重要作用。胆固醇流出(cholesterol efflux)是细胞内FC经细胞膜上的转运载体转运至细胞外接受体的过程,它是RCT的首要环节。ABC转运体(ATP-binding-cassette transporters, ABC)参与FC的跨膜转运。研究表明,ABCA1和ABCG1能够有效的将细胞内多余的胆固醇转运至细胞外接受体,如载脂蛋白AI (apolipoprotein AI, apoAI)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL),阻止胆固醇在细胞内的聚集。实验目的探讨eIF-2α磷酸化在ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出中的作用实验方法构建eIF-2α非磷酸化突变体(eIF2a-S51A),将空载体与eIF2a-S51A分别转染细胞建立稳定转染细胞系,用E+/B48脂蛋白、E-/B48脂蛋白和不加任何脂蛋白的培养基分别处理转染的细胞后,采用液闪法检测细胞内FC流出水平,用Western免疫印迹及实时定量PCR检测参与胆固醇转运的ABCA1和ABCG1的表达及翻译状况。实验结果1.胆固醇转运至apoAI和HDL的水平检测：空载体转染组,用E-/B48脂蛋白处理细胞后,胆固醇转运至apoA1和HDL的水平均低于E+/B48脂蛋白处理组细胞：当过表达eIF2a-S51A时,胆固醇转运至apoA1和HDL的水平在用E-/B48脂蛋白处理后明显升高。2. ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平检测结果：与对照组相比,无论是空载体转染组还是eIF2a-S51A转染组,E-/B48和E+/B48脂蛋白处理后ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平均明显增加；但是与E+/B48脂蛋白处理组相比,E-/B48脂蛋白对ABCA1和ABCG1蛋白表达的诱导程度明显降低；当过表达eIF2a-S51A时,E-/B48脂蛋白对ABCA1和.ABCG1蛋白表达的诱导程度增加。3. ABCA1和ABCG1转录水平和翻译效率检测：E-/B48和E+/B48脂蛋白对ABCA1和ABCG1转录水平的影响与蛋白表达趋势一致；E-/B48和E+/B48脂蛋白均未能改变ABCA1和ABCG1的翻译效率。实验结论1.E-/B48脂蛋白降低胆固醇流出；2.E-/B48脂蛋白降低胆固醇流出与其对ABCA1和ABCG1蛋白表达的低诱导能力有关；3.E-/B48脂蛋白降低胆固醇流出与ABCA1和ABCG1的翻译效率无关；4.抑制eIF-2α的磷酸化能够增加E-/B48脂蛋白对ABCA1和ABCG1mRNA及蛋白的诱导,增加胆固醇流出。试验还需从参与调节ABCA1和ABCG1表达的转录因子入手,进一步证实eIF-2a磷酸化是否通过影响那些转录因子的翻译效率,进而影响ABCA1和ABCG1的蛋白表达及它们介导的胆固醇流出。