【摘 要】
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CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌或古细菌体内、用于抵抗外来入侵核酸的自适应二次免疫系统,在疾病治疗、基因编辑与调控、生物传感等领域具有重要的应用潜力。其中,CRISPR/Cas12a是一种由42-44nt长的crRNA引导的、在对靶标DNA进行特异性切割后能触发单链DNA降解活性的II类V型CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas12a系统具有优异的靶向识别能力和高效的信号放大能
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CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌或古细菌体内、用于抵抗外来入侵核酸的自适应二次免疫系统,在疾病治疗、基因编辑与调控、生物传感等领域具有重要的应用潜力。其中,CRISPR/Cas12a是一种由42-44nt长的crRNA引导的、在对靶标DNA进行特异性切割后能触发单链DNA降解活性的II类V型CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas12a系统具有优异的靶向识别能力和高效的信号放大能力,已被用于构建多种基于CRISPR/Cas12a体系的DNA识别、编辑和检测系统,在生物传感领域具有巨大的潜力。然而,基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感仍然面临以下瓶颈问题:（1）靶标类型有限,检测靶标主要为核酸,小分子、蛋白等其它类型靶标应用有限;（2）检测灵敏度有限,不足以实现生物体内低丰度生物标志物的准确测量。基于此,本论文利用基因重组技术构建了CRISPR/Cas12a系统,发展了小分子响应的CRISPR/Cas12a系统活性调控新策略,构建了高灵敏CRISPR/Cas12a荧光传感器,实现microRNA的高灵敏生物传感。具体包括以下方面:在第二章中,我们首先建立了一套包含Cas12a蛋白和crRNA在内的完整CRISPR/Cas12a系统,为后续实验奠定基础。通过基因重组技术构建了含有AsCas12a蛋白目的基因的AsCas12a-p ET28a-TEV质粒载体,并通过诱导表达、提取、纯化等步骤,制备得到与商业蛋白活性相当的目的蛋白AsCas12a。同时,利用转录及提纯过程得到了具备识别活性的crRNA,初步得到了一套完整的CRISPR/Cas12a系统。为了达到最佳的酶活性效果,我们对反应时间、AsCas12a和crRNA的用量、离子浓度等关键条件进行了系统优化,进一步提高了体系的传感性能,为后续实验的开展提供了必要的实验基础。在第三章中,为了解决靶标类型有限的问题,我们发展了一种小分子响应的CRISPR/Cas12a系统活性调控新策略。该策略受巯基-二巯基交换反应的启发,设计了可与cr RNA互补的DNA链（cDNA）,将cDNA进行二硫键修饰后,可实现CRISPR/Cas12a体系活性的可激活式控制。通过对cDNA的设计进行系列优化,成功构建出GSH响应的CRISPR/Cas12a体系,为拓宽CRISPR/Cas12a体系的检测靶标类型提供了新的思路。在第四章中,为了提高CRISPR/Cas12a体系的检测灵敏度,我们结合滚环扩增方法,构建了一种高灵敏CRISPR/Cas12a生物传感器,能够实现肿瘤标志物micro RNA的高灵敏度、高特异性检测。同时,该体系可在正常人血清中实现准确率较高的加标回收,并实现了实际乳腺癌病患样品的辨别检测和相关细胞系内miRNA21表达水平的测定,为构建应用于即时检测场景中的CRISPR/Cas12a荧光传感器提供了新的思路。
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