肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF)是各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的共同途径。RIF是指由多原因引起的细胞外基质(extracellular matrix.ECM)成分在肾间质内过度沉积和肾间质成纤维细胞的增生。在不伴有RIF的肾脏疾病中,肾功能的恶化趋势较慢。因此,RIF越来越多的受到关注和重视,研究肾间质纤维化的发病机制对慢性肾脏疾病以及终末期肾衰竭的治疗和预后有临床意义。　　 有学者发现,RIF状态下的成纤维细胞约36%来源于肾小管上皮细胞。越来越多的证据表明,在肾间质纤维化中,肾小管上皮细胞可失去上皮细胞的表型,获得间充质的特点,如钙粘素(E-cadherin)的表达减少、表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),即肾小管上皮细胞在特定的病理状态下出现上皮细胞一间充质细胞(EMT)的逆向分化。此逆向分化涉及了一系列调控肾小管发育的胚胎基因的启动、激活及上调。目前研究较为清楚的细胞信号转导通路主要有TGF-β1/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、P38MAPK信号通路、Rho-ROCK信号通路等。各信号通路在不同的环节发挥作用,彼此亦发生关联,共同介导肾间质纤维化的发生和发展。TGF-β1是目前公认的最重要的促纤维化和EMT的细胞因子,TGF-β1在诱导的损伤性肾纤维化增量调节间质产物中起重要作用。近来研究发现,Wnt基因亦是诱导肾小管上皮细胞转分化的相关性基因。Β-catenin基因是Wnt信号通路的关键传递介质。β-catenin蛋白的NH2末端是GSK-3β结合位点,其缺失或突变会导致β-catenin不能与GSK-3β结合而不受它的降解,并在胞浆内得到累积。β-catenin最初作为与细胞膜上钙依赖性黏附分子E-cadherin相互作用的胞内分子得以分离和克隆,与E-cadherin,α-catenin相互作用,将细胞外黏附分子与胞质内细胞骨连接起来,参与细胞与细胞间相互粘连。Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化中起作用,然而信号通路在肾间质纤维化中的作用机制仍未明确阐明。　　 本研究采用大鼠肾小管上皮细胞系为研究对象,应用细胞免疫化学、Western-blot、RT-PCR技术,观察大鼠肾小管上皮细胞在TGF-β1诱导纤维化及施加WIF-1(Wnt抑制因子)干扰因素过程中α-SMAmRNA及蛋白与β-cateninmRNA及蛋白表达情况,探讨Wnt/β-catenin信号通路在大鼠肾小管上皮细胞向肌纤维母细胞的逆向分化机制中的作用及逆向分化与肾小管间质纤维化发生之间的关系。　　 材料和方法：　　 一、材料与分组　　 实验细胞:大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)。细胞株购于上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,由ATCC引进。将培养的细胞随机分为三组:　　 1组:正常对照组(N),以DMEM培养液为空白对照。　　 2组:纤维化组(通过TGF-β1诱导体外培养的大鼠肾小管上皮细胞,使其纤维化做为纤维化组,培养液中TGF-β1的浓度为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml3个浓度值,分别标记为T5、T10、T15)。　　 3组:WIF-1干预组(TGF-β1与WIF-1同时作用于大鼠肾小管上皮细胞做为WIF-1干预组),培养液TGF-β1的浓度为10ng/ml,WIF-1的浓度为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml3个浓度值,分别标记为T10W5、T10W10、T10W15。　　 各细胞组分别于24、48、72小时留取标本待测。同时1、2、3组进行爬片,分别于24、48、72小时后多聚甲醛固定后待测。　　 二、方法　　 各组细胞用免疫组化方法检测细胞爬片β-catenin和α-SMA蛋白表达情况。采用Western-blot方法检测纤维化组、WIF-1干预组和正常对照组的β-catenin和α-SMA蛋白的相对表达量。　　 采用RT-PCR检测上述指标的训RNA的相对表达量。　　 三、统计学分析　　 实验数据采用均数士标准差表示,采用SPSS13.0统计软件,组间比较采用t检验,各组内比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),以P＜0.05有统计学意义。　　 结果：　　 一、TGF-β1对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中α-SMA蛋白及mRNA表达的影响　　 免疫组化观察正常对照组α-SMA蛋白在肾小管上皮细胞少量表达;纤维化组24h在肾小管上皮细胞可见α-SMA蛋白表达增多,48h、72h表达明显(P＜0.05);且显著高于正常对照组(P＜0.05)。　　 Westernblot结果显示α-SMA蛋白水平在纤维化组48h相比正常对照组明显的增加(P＜0.05),随着纤维化时间延长α-SMA蛋白表达更加明显。　　 RT-PCR显示,α-SMAmRNA与α-SMA蛋白的表达趋势相同。　　 二、WIF-1对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中α-SMA蛋白及mRNA表达的影响　　 免疫组化观察正常对照组α-SMA蛋白在肾小管上皮细胞少量表达;WIF-1干预组24h在肾小管上皮细胞可见α-SMA蛋白表达较正常对照组增多,较纤维化组少,48h、72h表达显著低于纤维化组(P＜0.05)。　　 Westernblot结果显示α-SMA蛋白水平在WIF-1干预组48h相比纤维化组明显减少(P＜0.05),随着纤维化时间延长α-SMA蛋白表达无明显增加。　　 RT-PCR显示,α-SMAmRNA与α-SMA蛋白的表达趋势相同。　　 三、TGF-β1对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中β-catenin蛋白及mRNA表达的影响　　 免疫组化观察正常对照组β-catenin蛋白在肾小管上皮细胞少量表达;纤维化组24h在肾小管上皮细胞可见β-catenin蛋白表达增多,48h、72h表达明显(P＜0.05);且显著高于正常对照组(P＜0.05)。　　 Western-blot结果显示β-catenin蛋白水平在纤维化组48h相比正常对照组明显的增加(P＜0.05),随着纤维化时间延长β-catenin蛋白表达更加明显。　　 RT-PCR显示,β-cateninmRNA与β-catenin蛋白的表达趋势相同。　　 四、WIF-1对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中β-catenin蛋白及mRNA表达的影响　　 免疫组化观察正常对照组β-catenin蛋白在肾小管上皮细胞少量表达;WIF-1干预组24h在肾小管上皮细胞可见β-catenin蛋白表达较正常对照组增多,较纤维化组少,48h、72h表达显著低于纤维化组(P＜0.05)。　　 Westemblot结果显示β-catenin蛋白水平在WIF-1干预组48h相比纤维化组明显减少(P＜0.05),随着纤维化时间延长β-catenin蛋白表达无明显增加。　　 RT-PCR显示,β-cateninmRNA与β-catenin蛋白的表达趋势相同。　　 结论：　　 1、wnt/β-catenin信号通路参与大鼠肾小管上皮细胞-间充质细胞(EMT)的逆向分化,随着TGF-β1诱导纤维化时间的延长,β-catenin表达更加明显。以β-catenin为中心的Wnt/β-catenin信号通路参与了EMT的发生。　　 2、WIF-1(wnt抑制因子)干扰因素可成功阻断Wnt/β-catenin信号通路,影响α-SMA与β-catenin蛋白及mRNA表达。即WIF-1能拮抗Wnt/β-catenin信号通路中Wnt蛋白,从而阻断Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin肾小管上皮细胞转分化中的作用。