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单克隆抗体因其对靶点的高度选择性正在成为治疗癌症和自身免疫等疾病的首选药物。但是,由于单抗复杂的多结构域特点和大分子属性,使得其在应用上受到了一定的限制。纳米抗体是源自骆驼重链可变区的单域抗体,也是目前已知分子量最小且具有完全抗原结合能力的抗体片段,可作为单抗的理想替代。然而,由于纳米抗体分子小和缺乏Fc结构,体内半衰期过短,不能获得有效的体内治疗效果。因此,需要发展延长纳米抗体半衰期的策略,以改善其体内代谢特性。当前主要采用聚乙二醇化、融合Fc片段、与白蛋白结合以及靶向FcRn等策略延长小分子药物的血浆半衰期。但哪种方法对于延长纳米抗体的半衰期更有效,目前未见相关报道。因此,在本研究中,我们选择白蛋白结合域（ABD）和新生Fc受体结合域(ZFcRn),将其与我们前期获得的一株CD47特异的纳米抗体3D3-2进行融合,并在小鼠体内评价和比较了两种融合策略对改善纳米抗体半衰期的效果。本研究主要包括以下两部分:1.融合ABD和ZFcRn的重组CD47纳米抗体的制备和鉴定采用DNA重组技术,将合成的ABD和ZFcRn的DNA序列与纳米抗体3D3-2在羧基端通过一段连接子（G4S）3进行融合,并连接到表达载体上,构建重组质粒p ET22b-3D3-2-ABD和p ET22b-3D3-2-ZFcRn,转化大肠杆菌BL21（DE3）并进行IPTG诱导表达。表达的融合蛋白采用Ni离子亲和色谱柱纯化。结果显示,转化重组质粒的表达菌经过IPTG诱导后,在SDS-PAGE胶上显示明显的重组ABD和ZFcRn融合蛋白的表达,分子量大小分别为27 k Da和28 k Da,与预期相符。表达的纳米抗体经过亲和纯化后获得了纯度90%以上的纯化抗体,得率分别为5.5 mg/L和6.5 mg/L。Western blot显示其能与特异抗体结合。2.重组纳米抗体3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn的抗原结合及体内半衰期分析为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2与CD47抗原和血清白蛋白（SA）结合的影响,采用间接ELISA检测了3D3-2、3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn重组纳米抗体与人CD47、人血清白蛋白（HSA）以及鼠血清白蛋白（MSA）的结合,结果显示,三种纳米抗体与CD47之间均具有较高的特异结合活性,并具有明显的浓度依赖性。与3D3-2相比,融合后的3D3-2-ABD与3D3-2-ZFcRn与CD47的结合能力有一定降低,但不显著（p>0.05）。融合ABD结构域的纳米抗体获得了较强的与HSA和MSA特异结合能力,并具有明显的浓度依赖性。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体没有显示出与重组蛋白FcRn的结合活性。为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2延长血浆半衰期的作用效果,我们将三种重组纳米抗体对ICR小鼠进行单次尾静脉注射,在注射后的不同时间点采集血清样本,采用双抗体夹心ELISA法测定各个时间点血清中纳米抗体的浓度,并使用数据处理软件Graphpad prism 5绘制药时曲线并计算终末半衰期。结果显示,融合了ABD结构域的纳米抗体3D3-2-ABD比未融合的纳米抗体3D3-2血浆半衰期延长了约14倍,融合前后血浆半衰期分别为35.82 min和501.52min。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体3D3-2-ZFcRn血浆半衰期为71.65 min,与未融合抗体相比,效果不明显。另外值得注意的是,三种纳米抗体在对小鼠注射后7天都检测到了鼠抗纳米抗体的抗体反应,表明都具有免疫原性。总结以上结果,本研究通过融合ABD和ZFcRn结构域获得了两种新的重组CD47纳米抗体,融合ABD和ZFcRn不影响纳米抗体与CD47抗原的结合,而融合ABD后CD47纳米抗体可以与HSA和MSA特异结合。小鼠体内代谢实验表明,纳米抗体与ABD融合后可以显著提高其血浆半衰期。本研究结果为延长纳米抗体体内代谢提供了一种可行的策略,对改善纳米抗体药物的体内药效具有一定参考价值。