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研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是世界范围内癌症致死的主要原因之一,多药耐药(MDR)是其化疗失败的关键原因之一。在乳腺癌发病过程中,随着MDR进展,肿瘤细胞开始对一系列结构不同、靶点不同的抗肿瘤的药物都产生了抵抗作用,从而严重影响化疗效果。化疗过程中引起MDR的原因有很多且机制复杂。人类多药耐药基因1(MDR1)编码一个位于细胞膜上的排出泵蛋白——P-糖蛋白(P-gp)。MDR1/P-gp过度表达使细胞膜上排出泵功能活跃,导致肿瘤细胞对于化疗药物抵抗。目前,对于这类具有MDR现象的癌细胞,恢复其化疗敏感性的措施十分有限。CUL4A是一种新近发现的在乳腺癌中过度表达的癌基因,编码E3泛素连接酶复合体的一个核心蛋白。这个复合体通过泛素化修饰和降解多种靶蛋白,调节多种重要的生理活动,如细胞周期、DNA复制、DNA修复和染色体重构等。在乳腺癌病人中,CUL4A过度表达常与较差的预后密切相关。最近的研究证明,在前列腺癌中CUL4A与MDR相关,但是乳腺癌中CUL4A与MDR的关系尚未见报道。ERKl/2细胞信号通路对癌细胞增殖、侵袭力和生存具有调节功能。最近有研究显示在前列腺癌细胞系中,CUL4A通过促进H3K4me3与ERK1/2基因启动子的结合而促进ERK1/2的表达。根据以上报道,我们推测在乳腺癌中,CUL4A可能通过对ERK1/2通路的调节作用来调节MDR。实验目的探究乳腺癌中CUL4A与MDR之间可能的关系及相应机制。材料和方法本实验中我们将逆转录病毒表达载体pBabe-puro-CUL4A及其相应的空白质粒pBabe-puro分别在逆转录病毒介导下感染乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF7,构建CUL4A稳定表达的人乳腺癌细胞系；同时将pSuper-retro-CUL4A及相应的空白质粒感染阿霉素耐药的人乳腺癌细胞系MDA-MB-468/Adr及MCF7/Adr,建立CUL4A基因沉默的细胞系。利用质粒中包含的嘌呤霉素抗性基因进行筛选,最终获得高纯度的、CUL4A稳定高表达或沉默的细胞系。随后,利用建立的稳定转染细胞系,通过MTT实验测定药物半数致死量,用于证明CUL4A的表达与P-gp底物药物多药耐药的相关性。然后通过RT-PCR以及Western blot技术,从转录和翻译水平上检测CUL4A对MDR1/P-gp表达的影响。随后应用已建立的稳定转染细胞系及ERK1/2通路特异性抑制剂PD98059,进一步分析CUL4A对细胞多药耐药的影响是否与ERK1/2通路有关。最后,在乳腺癌临床标本上,应用免疫组织化学方法,检测CUL4A与ERK1/2、P-gp的表达,分析其相关性。结果1)建立了对阿霉素耐药以及CUL4A稳定上调/下调的乳腺癌细胞系；2)在乳腺癌细胞中,CUL4A对MDR1的表达起到正向调节作用；3) MCF7/Adr细胞中CUL4A基因沉默导致P-gp底物药物抵抗性的下降。反之在MCF7细胞中调高CUL4A的表达水平会导致P-gp底物药物抵抗性的提高；4) CUL4A通过转录调节激活ERK1/2信号通路,并且ERK1/2是CUL4A调节P-gp表达过程中的中间蛋白；5)临床乳腺癌标本中P-gp的表达水平与CUL4A和ERK1／2表达水平高度相关。意义本次研究首次阐明了CUL4A参与乳腺癌多药耐药,并对相应机制进行了初步探讨。