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目的将培养的人神经干细胞(hNSCs)，经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的新生鼠脑后，观察植入细胞的存活、迁移及分化。探索新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的可能治疗方法。
方法1.细胞准备：取孕12周人胚胎脑组织，制备成单细胞悬液，接种于N2培养基中(D/F12+N2+B27)，细胞接种浓度为1×105/ml，培养基中添加表皮生长因子(EGF)20ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、白血病抑制因子(LIF)1ng/ml，培养至第5天加等量上述培养液，继续培养至第11天，获取生长旺盛的人神经干细胞(hNSCs)球(每个细胞球约数十个细胞构成，未传代)，制成细胞悬液，细胞数约为5.0×105cells/ul。待移植时用。移植后2周时间点的新生鼠植入的NSCs培养至第6天用PKH(为进口试剂盒，sigma公司标记)神经干细胞膜，示踪移植后NSCs。
2.外源性神经干细胞移植：SD新生大鼠(n=80)生后第7天进行HIBD模型制作，模型制作后3天神经干细胞移植组予人NSCs移植，移植对照组予生理盐水移植。准备移植的幼鼠麻醉后固定在立体定向仪上，hNSCs注入左侧(损伤侧)脑室，注射位点依幼鼠体重不同如下：AP=-1mm，ML=-1～-1.5mm，DV=-3.5～-4mm。通过微量注射器注射5μl。(细胞浓度为5.0×105cells/μl)。移植后动物不予免疫抑制剂。移植后1周、4周及3月的鼠过量麻醉后，4％的多聚甲醛心脏灌注，取脑，石蜡包埋，矢状切片(10um)；移植后2周的鼠常规灌注、取脑，冰冻切片，矢状位。用PKH，小鼠抗-人神经丝蛋白(anti-NF)单克隆抗体作为一抗标记神经元，罗丹明标记山羊-抗小鼠IgG、FITC标记山羊-抗小鼠IgG作为二抗行免疫组织化学染色。观察移植细胞的存活、迁移及分化。
结果1.细胞鉴定：hNSCs球行免疫细胞化学染色后，可见80％的细胞表达Nestin阳性。分化诱导后予特异性细胞表面标记(GFAP、NF)鉴定，hNSCs球可分化为神经元、星形胶质细胞。确定细胞球具有增殖及分化的干细胞特性。
2.模型鉴定：我们采用Jansen等改良后的HIBD模型制作，可获取较稳定的模型，损伤程度为中－重度。此过程有一定的死亡率发生，存活率为85～90％。模型行HE检查可见：HI后第二天脑间质水肿，小血管间隙增宽；HI后第一周神经元肿胀，皮质神经元排列紊乱，核固缩、崩解，细胞浓染，HI后二周神经元坏死进一步明显，细胞核固缩，溶解，并见小胶质细胞浸入。大脑半球两侧损伤以左侧明显，部位以皮层、海马、纹状体为主。
3.外源性植入细胞的存活、迁移及分化：移植后1周大量抗-NF阳性的植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区，以损伤侧皮层、海马多见，在不同区域可见与宿主细胞类似的分化的植入细胞。脑室移植NSCs没有破坏脑组织结构，遍及前脑和小脑进行迁移。一些NSCs在皮层、海马、表达神经丝蛋白，分化为神经元细胞。NSCs也居住在神经元丰富的区域内包括海马回，嗅球，小脑的外粒层。此外神经微丝的阳性供体细胞也在脑干网状结构内形成。移植后2周到达损伤区移植细胞神经微丝更长，数量与移植后1周组相当。移植后4周及3月植入细胞数较前明显减少。
结论1.来源于人的胎脑NSCs在含有EGF、bFGF、LIF的培养基中形成小的NSCs球，具有良好的增殖、分化能力，移植至HI损伤的新生鼠脑中能存活、迁移及分化。
2.本实验证明：新生鼠HIBD后移植NSCs后1周，植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区，以损伤侧皮层、海马多见，在不同区域分化为与宿主细胞类似的神经细胞，脑室移植NSCs没有破坏脑组织结构，遍及前脑和小脑进行迁移。一些NSCs在皮层、海马、表达神经丝蛋白，分化为神经元细胞。NSCs也居住在神经元丰富的区域内包括海马回，嗅球，小脑的外粒层。此外神经微丝的阳性供体细胞也在脑干网状结构内形成。人NSCs移植至HI损伤的新生鼠脑中能存活、迁移及分化。