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研究背景： 侵袭性和转移性是恶性肿瘤的重要标志,事实上,当发现肿瘤原发病灶时,肿瘤细胞已以微小克隆的形式发生了全身性的播散,成为肿瘤复发的种子。在女性恶性肿瘤中,卵巢癌病死率位于首位,严重威胁妇女的身心健康,由于发病隐匿,早期缺乏特异性症状与体征,迄今仍缺乏早期诊断方法,确诊时60％～70%的患者已属晚期,在手术或联合化疗后仍有50%～80%的患者复发。所以,侵袭和转移是卵巢癌治愈困难的瓶颈所在,深入了解其发生的分子机制,能为卵巢癌的治疗提供理论依据。 肿瘤的发生和发展是一个涉及多种癌基因和抑癌基因改变的复杂的病理现象,其中RhoA(Ras homologue member A)基因参与了肿瘤发生发展的多个重要过程,它通过调控细胞的形态和运动的能力参与肿瘤细胞的侵袭和转移,因而成为近期研究的热点。RNAi(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术,原理是内源性或外源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在生物体内引起同源靶基因的mRNA的序列特异性沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)过程,属于转录后基因沉默,RNAi技术由于其高效性和特异性成为目前基因沉默的首选工具,然而如何更好地将其优势发挥到临床生物治疗却是个难题。本实验通过构建慢病毒载体,采用RNAi技术沉默rhoA基因的表达,研究RhoA基因在卵巢癌细胞侵袭和转移过程中的作用机制,以期为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。 研究目的： 本研究以人卵巢癌细胞HO8910为模型,通过包装针对RhoA基因的shRNA慢病毒干扰载体,建立RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过体外实验研究沉默RhoA基因对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响。 研究方法： 1、高表达RhoA基因的人卵巢癌细胞株的筛选 采用Western blot法在蛋白水平上检测四种不同转移潜能人卵巢癌细胞株HO8910、ES-2、SKOV3和OVCAR3细胞中RHOA蛋白的表达情况,从而筛选出高表达人RhoA蛋白的卵巢癌细胞株进行后续实验。 2、RhoA-shRNA真核表达载体的构建、鉴定及高干扰效率片段的筛选 使用公用网站设计、筛选符合相关参数的序列3条,由上海吉凯基因技术有限公司合成。与psiHIV-U6质粒重组后,转染感受态大肠杆菌,阳性克隆经过PCR鉴定以及DNA测序鉴定后,提取重组质粒;利用脂质体转染293T细胞,通过实时荧光定量PCR法检测3条序列的干扰效率,筛选出高干扰效率片段进行慢病毒包装及后续实验。 3、慢病毒RhoA-shRNA-sh/NC-LV的制备、感染细胞HO8910及稳定克隆的建立 在293T细胞中进行慢病毒的包装、收集及滴度的测定,慢病毒感染人卵巢癌细胞,通过嘌呤霉素稳定筛选及扩大培养,获得RhoA基因稳定沉默的卵巢癌细胞株,荧光显微镜观察转染效率,采用实时荧光定量PCR和western blot法分别从mRNA及蛋白水平检测稳定克隆中RhoA基因的表达。 4、沉默RHOA基因对卵巢癌细胞侵袭和转移能力的影响 利用细胞计数及MTT实验从细胞数量和细胞存活率上描述细胞生长状况;采用黏附实验检测细胞的黏附能力。采用细胞划痕实验、Transwell侵袭及迁移实验检测细胞的体外侵袭及迁移能力;采用体外血管形成实验检测细胞诱导血管形成的能力。 结果： 1、成功筛选出高表达基因的卵巢癌细胞株:HO8910细胞株. 2、成功构建了针对RhoA基因三个不同位点的RNAi真核质粒,经酶切和测序鉴定与实验设计合成的RhoA靶基因序列完全一致;将重组质粒转染293T细胞后,实时荧光定量PCR结果显示psiHIV-U6-RhoA-sh1/2/3均可产生干扰效果,以psiHIV-U6-RhoA-sh2效果最佳。 3、成功包装慢病毒RhoA-shRNA-sh-LV、RhoA-shRNA-NC-LV,将其感染卵巢癌细胞,经嘌呤霉素加压筛选后,实时荧光定量PCR及Western blot检测,结果显示,干扰组细胞中RhoAmRNA和蛋白的相对表达率分别为(30.70±5.40)%、(32.08±5.46)%,通用阴性对照组为(95.90±6.53)%、(60.58±6.21)%,H08910组为(100.0±4.37)%、(59.25±4.52)%,干扰组与其他两组对比差异有统计学意义(P<0.05),表明成功构建了RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株。 4、人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株的体外增殖能力、侵袭和迁移能力、诱导血管形成能力、黏附能力较对照组明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 1、成功构建针对RhoA基因的慢病毒干扰载体,可长久稳定地抑制卵巢癌细胞HO8910中RhoA基因的表达。 2、沉默RhoA基因能抑制卵巢癌细胞的生长及侵袭和转移。