羧酸酯水解酶,主要催化酯类化合物的水解反应和合成反应。脂肪酶和酯酶是脂解酶的两个主要的家族。在某些条件恶劣的工业生产过程中,由于其固有的热稳定性和耐有机溶剂的功能,并结合其较高的化学选择性,区域选择性和对映体选择性,使酯类水解酶在各种工业应用中成为了非常有吸引力的生物催化剂。同时,从极端微生物来源的酶还可能拥有一些额外的功能,例如在极高或极低的温度,极端的pH值或高盐度的水平下活动,这一点可能引起某些有特定目的的产业的兴趣。其中,酯酶主要发现于植物、动物和微生物中,并且大多数工业酯酶都来源于微生物。同时,醋酶是非常经济、高效的生物催化剂,在食品工业包括营养改善、风味形成及食品发酵中有着广泛应用。依靠传统方法,新的脂肪酶和酯酶是通过分离产生酯解活性的微生物纯培养菌株发现的。而进入基因组时代,基因组项目使基因挖掘成为可能,利用与已知的脂肪酶和酯酶的同源性,就可搜索新型酯解酶。宏基因组时代的来临更意味着基因组这一领域宏基因组的研究向前迈进了一大步,宏基因组即指某一环境中微生物群落所有基因组的集合。目前,分子生物学技术已经可以用来构建环境总DNA库,包括不可培养微生物的基因组,这为发现具有独特性质的、新颖的未知酶类的广阔领域打开了一个新的窗口。另外,可以用宏基因组文库进行功能筛选,检测具有酯解活性的克隆。这种筛选方式的成功依赖于所克隆基因与异源宿主的转录翻译元件是否具有兼容性,通常会选用大肠杆菌作为此类宿主。在本研究中,本实验室采集来源于我国云南栗树林地区的土壤样品,并成功构建了一个高质量的宏基因组科斯质粒文库。通过利用该文库进行功能筛选,我们发现了两个新型酯酶EstGX1和EstGX2。多序列比对及进化树分析表明,这两个预测蛋白酶均为微生物脂类水解酶第IV家族的新成员。聚丙烯酰胺蛋白胶分析表明纯化后的EstGX1和EstGX2几乎显示为一条带,它们的分子量大小与预测的分子量31kDa和33 kDa相一致。随后,本实验对纯化酯酶EstGX2的生化特性进行分析,处理的相关酶学特性包括最适pH、最适温度以及该酶对有机溶剂和金属离子的耐受性。EstGX2的最适温度为50℃,最适pH为9.0。然而,在极酸和极碱(>pH 10.0)的条件下,该酯酶会失去对最适底物对硝基苯酚丁酸酯的水解能力。特别值得一提的是,EstGX2在99℃反应55分钟后仍能保持约40%的活性,且该酶在15%乙醇存在的体系中水解活性竟会有所提高。EstGX2的这些特性,包括在超高温中的稳定性以及在有机溶剂中的稳定性,可能使EstGX2成为食品工业中一个颇有潜力的候选酶。