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目的:通过观察香烟烟雾提取物(CSE)对铜绿假单胞菌毒力及耐药性的作用并探讨其机制,为香烟烟雾暴露与呼吸系统感染的理解提供新的思路。研究方法:第一部分:制备CSE:3R4F参比卷烟燃烧的香烟烟雾注入胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中制备CSE,以1支香烟的烟雾注入10ml肉汤的浓度作为100%的CSE浓度,通过测量OD260评价批次间CSE重复性。将对数期的铜绿假单胞菌暴露于10%浓度CSE(以TSB稀释)作为CSE暴露组,同时用空白TSB肉汤培养的铜绿假单胞菌作为对照组,测定CSE暴露组和对照组OD620评价两组细菌的生长状态差异,并用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)离心冲洗3次,调整细菌浊度至0.5麦氏浓度(OD600=0.1)进行稀释平板培养。用上述两组细菌分别构建小鼠急性肺部感染模型,观察小鼠一般状态、病死率、肺组织病理、肺组织及脾组织细菌载量、肺泡灌洗液及血清TNF-α和IL-6水平,评价经过CSE处理后铜绿假单胞菌的毒力变化。通过转录组测序结合生物信息学分析探讨CSE对铜绿假单胞菌毒力作用的机制。第二部分:以第一部分CSE暴露方法,通过微量肉汤稀释法药敏试验检测铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)以及肉汤培养法检测最小杀菌浓度(MBC),评价CSE处理后铜绿假单胞菌对临床常见抗菌药物的耐药性的变化。并结合转录组测序结果进行相关基因的PCR验证。结果:1.CSE对铜绿假单胞菌毒力的作用CSE暴露组和对照组铜绿假单胞菌培养至对数期,培养后0.5麦氏浓度对应1*10~8 cfu/ml。小鼠气管插管滴注1*10~5 cfu铜绿假单胞菌成功构建肺炎模型。同对照组相比,CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠随病情演变出现不同特征:1.小鼠一般状态:CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠自感染后24h始活动明显减少,眼角出现脓性分泌物,部分小鼠伴腹泻。2.病死率:在10天的观察期结束时,CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠病死率显著高于对照组病死率(70%对30%,p<0.05)。3.肺组织病理学:CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠肺组织大体观可见更严重的红细胞渗出,光镜下可见更严重的炎性细胞浸润和肺泡单位破坏。4.肺组织和脾组织细菌载量:CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠肺组织细菌载量显著升高。与对照组小鼠脾组织无菌不同,CSE暴露组小鼠脾组织亦可培养出铜绿假单胞菌。5.血清及肺泡灌洗液炎症因子检测:CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠肺泡灌洗液呈洗肉水色,可见红细胞沉淀。CSE暴露组铜绿假单胞菌感染的小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α及IL-6水平与PBS对照组小鼠相比均有升高(p<0.05)。且相比PA感染组,CSE-PA感染组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α及IL-6水平升高更为显著(p<0.05)。6.转录组测序结果提示CSE诱导铜绿假单胞菌鞭毛组装相关基因、双组分调节系统PhoQ/P的高表达以及III型分泌系统相关基因的低表达。2.CSE对铜绿假单胞菌耐药性的作用微量肉汤稀释法提示CSE可以提升铜绿假单胞菌对左氧氟沙星、亚胺培南、替加环素和米诺环素的最小抑菌浓度。从微量肉汤稀释法的抑菌孔内获取的菌液加入胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养后进一步证实CSE可以提升铜绿假单胞菌对亚胺培南和左氧氟沙星的最小杀菌浓度。PCR结果提示CSE诱导铜绿假单胞菌转录因子mvaT低表达,上调mexE/mexF-opr N的同时下调opr D。结论:香烟烟雾提取物诱导铜绿假单胞菌向更强的毒力表型转化,表现为小鼠模型出现更严重的肺部病变、更高的肺部和血液循环细菌载量、更严重的脓毒血症和更高的病死率。其机制与铜绿假单胞菌鞭毛组装相关基因、双组分调节系统PhoQ/P的高表达以及T3SS相关基因的低表达有关。香烟烟雾提取物提升铜绿假单胞菌对左氧氟沙星、亚胺培南、替加环素和米诺环素的耐药性。其机制为诱导转录因子mvaT低表达,上调mexE/mexF-opr N的同时下调opr D。使铜绿假单胞菌向nfxC耐药表型转化。