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荧光技术包括荧光光谱、激光共聚焦显微镜技术、荧光定量PCR、和荧光各向异性等,其广泛应用于生物化学及分子生物学研究中,是研究生物大分子的结构和功能,以及分子间相互作用的重要手段之一。microRNA（miRNA）是一类长约20-24 nt的非编码小分子RNA,于转录后水平上负调控靶mRNA从而影响基因的表达,对生物的生长、发育、分化等生命活动起重要调控作用。在动植物中,miRNA的生物合成途径已被广泛研究,miRNA的形成过程较为清晰。其中Dicer/Dicer-like（DCL）蛋白作为核糖核酸酶III家族的成员,在小RNA生物合成途径中起关键作用。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）属单细胞真核微藻,是研究鞭毛的组装和运动、光合作用以及多种代谢途径的模式生物,具有“光合酵母”之称。莱茵衣藻miRNA相关研究起步较晚,研究表明莱茵衣藻DCL3蛋白参与miRNA的生成,但DCL蛋白在衣藻miRNA生物合成中的作用机制尚不清楚。同时,短串联靶向模型（STTM）技术近年被广泛用于动植物细胞中,可特异性抑制目标miRNA的表达,但STTM能否调控单细胞生物莱茵衣藻miRNA的表达尚不清楚。本文通过生物信息学与荧光技术相结合的方法,研究了莱茵衣藻DCL蛋白在细胞内的分布及其结构域与双链RNA（dsRNA）结合特征;通过小RNA组学结合荧光定量PCR技术,发现衣藻DCL1蛋白参与miRNA的生物合成;利用基因编辑与荧光定量PCR技术,测试了STTM结构对衣藻miRNA表达的作用效果。具体研究结果如下:（1）对多个物种的Dicer同源蛋白进行同源分析及结构域预测,结果表明莱茵衣藻DCL蛋白与红酵母（Rhodotorula toruloides）Dicer蛋白同源度最高,均不含有与dsRNA结合的关键结构域:PAZ和dsRNA结合结构域。初步揭示了在Dicer蛋白进化过程中PAZ和dsRNA结合结构域从无到有的过程。（2）通过激光共聚焦显微镜技术,对衣藻DCL1和DCL3蛋白的5’端序列进行亚细胞定位分析,结果表明2个DCL蛋白主要分布于细胞核,少量分布于细胞质。由此推测:衣藻DCL蛋白主要是在细胞核内对miRNA前体进行剪切加工。（3）对衣藻DCL蛋白的DUF283结构域与pre-miR1162 dsRNA进行多个光谱学实验及等温滴定量热技术检测,结果表明DUF283结构域与pre-miR1162通过疏水作用力相互结合,该过程使DUF283结构域的色氨酸残基暴露于疏水环境中,蛋白肽键发生π→π*电子跃迁,蛋白更多的二级结构转为α-螺旋结构,且该结合过程为吸热反应。（4）通过生物信息学分析,发现衣藻DCL1-3的互作蛋白,及衣藻DCL1与PSRP-1、PRPS16、ABH1、CPL4和MRPS6蛋白的结合位置。（5）通过对照组CC-5325和dcl1突变株进行小RNA组学测序与分析,获得85个已报导的miRNAs（cre-miRNAs）,7个高度保守的miRNAs和822个新预测的miRNAs（novel-miRNAs）,并对miRBase数据库中的19个miRNAs进行校正。比对dcl1突变株和对照组CC-5325的miRNAs表达水平,发现105个表达显著上调的miRNAs和28个显著下调的miRNAs。（6）利用荧光定量PCR技术检测组学数据中12个显著下调miRNAs在CC-5325、dcl1和dcl3突变株中的表达水平,结果显示在dcl1突变株中12个miRNAs均显著下调,而在dcl3突变株中有4个miRNAs显著下调。通过Northern印迹杂交对cre-miR910、novel-miR0128-5p和novel-miR0537-3p的表达水平进行检测,结果显示3个miRNA在dcl1和dcl3突变株中显著下调。上述结果表明DCL1和DCL3均参与miRNA的生物合成,并揭示了衣藻部分miRNA的生物合成途径不同于动植物,其可能由多种DCL蛋白共同参与。（7）对组学数据中28个显著下调的miRNAs进行靶基因预测及靶基因功能分析,获得5个参与脂肪酸代谢途径的miRNAs。对对照组CC-5325、dcl1和dcl3突变株进行油脂含量检测,结果表明dcl1和dcl3突变株的各油脂含量较对照组无显著差异,仅有硬脂肪酸甲酯存在从无到有的变化。初步推测DCL1相关的5个miRNA参与脂肪酸代谢途径,但该miRNA在衣藻中的调控较为微弱,对脂肪酸含量无显著影响。（8）分别构建3个以衣藻miRNA(（miR906-5p、miR1166.1和miR1150.3）为靶标的STTMs转基因藻株,并通过荧光定量PCR技术检测转基因藻株miRNA表达水平,结果显示3种STTM转化子的靶miRNA均显著下调,其中对miR1150.3、miR906-5p和miR1166.1的抑制率分别为84%、79%和73%。值得注意的是,在3种STTM转化子中,多个非靶miRNA的表达水平也显著下降,表明STTM对衣藻miRNA的非特异性抑制,揭示了STTM对衣藻miRNA的作用机制不同于动植物。综上所述,莱茵衣藻DCL1和DCL3蛋白均能参与miRNA生成合成,有些miRNA的生物合成需要两种DCL蛋白共同参与。STTM对莱茵衣藻miRNA具有非特异性抑制作用。这些研究结果为进一步理解单细胞真核微藻miRNA的生物合成及作用机制打下了坚实的基础。