籽粒灌浆决定着水稻的产量和稻米品质,但影响灌浆的关键因子仍未完全阐明。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解途径的一个关键限速酶,其催化底物PEP和产物丙酮酸是细胞内物质合成与代谢的重要前体。研究表明植物中丙酮酸激酶基因参与各种生理过程,如调控种子发育和贮藏物质合成、叶片中糖的代谢和茎中同化物的转运等。因此,进一步探究水稻PK基因的功能对完善水稻籽粒灌浆调控网络具有重要意义。本课题前期获得一份T-DNA插入的灌浆缺陷突变体（ospk3）,研究发现该突变体表型是一个预测的PKc基因（OsPK3）功能丧失所致,于是我们系统研究了该基因的表达模式、亚细胞定位、其蛋白互作亚基及功能等。主要结果如下:1.与野生型相比,ospk3突变体表现出株高低、穗更短、穗粒数减少、结实率下降;从受精后15天开始灌浆速率显著变慢,且未灌浆充实的瘪粒明显增加,导致粒厚和千粒重显著降低;米质分析显示突变体垩白粒率显著升高,粉质化严重。组织细胞学分析显示突变体胚乳中的淀粉粒小而圆、排列更疏松,淀粉粒数量明显少于野生型。2.通过T-DNA插入边界序列分析,ospk3突变体的T-DNA插入在基因Os04g58110（OsPK3）起始密码子下游1843 bp（第2内含子）的位置,并导致了OsPK3在突变体叶片和发育颖果中的表达量极低;进一步获得该基因Dongjin背景的敲除突变体,证实OsPK3的突变导致了ospk3的突变表型。3.定量PCR分析发现OsPK3在水稻中呈组成型表达,但是在叶片和发育的颖果中高表达。GUS染色结果显示在叶片、茎及颖果均能检测到OsPK3启动子的表达活性;GUS染色组织切片观察,OsPK3在蔗糖转运及卸载的组织表现出特异的表达信号,包括叶片叶肉细胞和维管束韧皮部伴胞,茎节间的维管束韧皮部伴胞,节上扩大维管束（EVBs）的薄壁细胞桥（PCB）以及受精后9天颖果的珠心突起、珠心表皮、糊粉层细胞和背部维管束。这些结果表明OsPK3在水稻的叶片、茎和颖果中起着重要作用。另一方面,亚细胞定位显示OsPK3蛋白结合在线粒体表面,不存在于胞质中。4.OsPK3功能的丧失会导致水稻叶片和颖果中的丙酮酸激酶活性和其催化产物丙酮酸的含量均显著降低。5.在灌浆过程中,测定叶片、茎秆和颖果中糖含量的结果表明,ospk3和敲除株系的叶片中蔗糖含量显著增加,总淀粉含量明显积累,而茎秆中蔗糖含量显著降低,颖果中蔗糖、葡萄糖和果糖含量也显著降低,且总淀粉和直链淀粉含量下降。定量PCR分析表明ospk3和敲除株系发育颖果中多个蔗糖转运及淀粉合成相关基因的表达量显著上调。结合叶片、茎秆和颖果中糖含量的结果分析,表明OsPK3功能丧失会导致光合同化产物蔗糖从叶片到颖果的运输受阻,进而影响籽粒中淀粉合成,最后导致淀粉粒发育差、籽粒垩白增加和千粒重下降。6.通过Bi FC对OsPK3与其他胞质丙酮酸激酶同工酶间的互作分析,发现OsPK3能够分别与OsPK1和OsPK4产生互作信号,但不能与Os03g20880,Os01g16960,Os11g10980编码蛋白互作或进行自我绑定。CO-IP实验进一步证实OsPK3与OsPK1和OsPK4的互作,但OsPK1和OsPK4之间并不存在互作。Native-PAGE实验表明OsPK3能够分别与OsPK1和OsPK4在体外形成异源二聚体。7.OsPK1和OsPK4在水稻中呈组成型表达,但具有各自的表达特征。OsPK1主要在叶片和发育颖果中高表达,类似于OsPK3的表达模式,而OsPK4则主要在发育的颖果中高表达;进一步亚细胞定位显示OsPK1和OsPK4同时存在于胞质和线粒体,并且通过蛋白间的相互作用,OsPK1和OsPK4能够被OsPK3招募至线粒体。8.对OsPK1和OsPK4敲除突变体的农艺性状考察发现,ospk1突变体表现出类似ospk3的突变表型,包括株高变矮,粒重降低和垩白粒率升高;而ospk4突变体主要表现出严重的籽粒垩白;ospk3;ospk1和ospk3;ospk4双突均表现出类似ospk3的突变表型。综上所述,OsPK3能够通过与OsPK1和OsPK4的互作将其招募到线粒体表面组装成不同的丙酮酸激酶复合体行使催化功能,其中OsPK3-OsPK1蛋白复合体作用于水稻整个生长发育时期,影响光合同化产物蔗糖从叶片到颖果的运输,而OsPK3-OsPK4蛋白复合体主要在籽粒发育过程起作用,加速蔗糖在颖果的卸载,进而影响胚乳中淀粉合成、复合淀粉粒的发育和籽粒灌浆。