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本文包括两方面研究内容:引种紫锥菊的显微鉴别和紫锥菊中菊苣酸的定性定量分析和半边莲醇提物抗流感病毒药效研究。
紫锥菊是菊科(Asteraceae)紫锥菊属(即松果菊属)(Echinacea)植物,自然分布于美洲地区,近年来我国北京、上海、南京、广州等地先后成功引种。由于紫锥菊在增强机体免疫力和抗炎方面效果显著,使其受到广泛关注。菊苣酸是紫锥菊中重要免疫活性成分,菊苣酸的含量情况通常成为紫锥菊相关研究的重要指标。本部分试验旨在建立菊苣酸的定性定量分析方法,并对广州地区引种栽培的紫锥菊不同部位中菊苣酸的含量进行测定,为引种紫锥菊质量标准的建立及其开发利用提供科学依据。
本部分试验采用显微镜镜检的方法鉴别紫锥菊的显微结构;采用薄层层析(TLC)法定性鉴别紫锥菊根、茎、叶和花中的菊苣酸,所用的展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3:6:1);采用高效液相色谱(HPLC)法测定各部位中菊苣酸的含量,色谱柱为XTerraC18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,流速为1.0mL.min-1,紫外检测波长为326nm。
结果:紫锥菊中的菊糖、导管、非腺毛、纤维束和表皮细胞等成分或组织在40倍显微镜下观察,均具有明显特征的显微结构,可作为显微镜鉴别紫锥菊的依据。TLC中菊苣酸的斑点清晰可辨,Rf值为0.72。HPLC测得菊苣酸的进样浓度在0.5~100μg.mL-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.9999),方法的平均回收率为95.3%(RSD=3.57%),广州地区产紫锥菊中根、茎、叶、花中菊苣酸的含量分别为:12.1,0.68,5.60,2.47mg.g-1。
半边莲(Lobelia chinensis Lour)为桔梗科半边莲属草本植物,常生于水田边、路沟旁及潮湿的阴坡荒地上,主要分布于我国长江以南及台湾地区。其具利尿消肿、清热解毒之功效,常用于治疗带状疱疹、急性肾炎、蛇咬伤等。本课题组在抗流感药物筛选中发现半边莲具有较好的体内外抗流感病毒作用,本文在已有工作基础上,对半边莲醇提物的抗流感病毒作用及其机制进行深入研究。本试验首先建立H9N2AIV小鼠感染模型,采用15~17g的BALB/c鼠测定H9N2AIV的半数致死量(LD50);然后用2倍LD50攻毒小鼠,小鼠的发病率达100%,死亡率达80%,100mg/kg/d的利巴韦林对照组感染小鼠存活率达90%~100%,证明该小鼠试验模型成功可行;在此基础上对半边莲提取物抗流感病毒的药效进行进一步的评价,并探讨其作用机制。
小鼠感染实验结果表明,与病毒对照组相比,半边莲提取物105mg/kg的剂量有比较好的的生命保护作用(P<0.05),生命保护率为40%,生命延长率为58.9%;半边莲醇提物对因流感病毒感染引起的脾脏和胸腺等免疫器官的萎缩有一定的抑制作用。而且还有一定的抑制H9N2亚型流感病毒引起的小鼠肺炎实变的功效,与病毒对照组相比,肺指数差异显著(P<0.01),肺指数抑制率为31.6%;半边莲醇提物对感染H9N2流感病毒的小鼠肺部病毒的增殖有一定的抑制作用,第10d小鼠肺病毒已完全被清除(P<0.01);对小鼠肺匀浆中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α几种炎症因子的含量也有一定的抑制作用,从而阻止肺炎进一步恶化,对感染病毒小鼠起到保护作用。