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一、研究背景
结肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居各类肿瘤的前列，已严重影响到人们的生活质量。结肠癌临床治疗常采用的方式有手术切除、放疗、化疗、免疫疗法和分子靶向治疗等。手术切除主要适用于早期局限转移的肿瘤患者，如Ⅰ期结肠癌，Ⅱ、Ⅲ期结肠癌则采用手术与化疗结合治疗，而进展性晚期结肠癌治疗主要以化疗为主。可见在各阶段结肠癌的治疗中，化学药物治疗占有重要地位，已成为结肠癌的主体治疗方式。
氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和伊立替康(Irinotecan)是临床治疗结肠癌常用化疗药，其中5-FU作为结肠癌的基础药物，在过去40多年中一直是重要的化疗主体药物，是目前临床上应用最广的尿嘧啶类抗代谢药物，属于不典型的细胞周期特异性药，除了主要作用于S期细胞外，对处于细胞周期其它时相的细胞亦有作用。该药的疗效显著，抗癌谱较广。然而，5-FU会对患者产生的较强毒副作用以及难以逆转的耐药性。鉴于5-FU等结肠癌化疗药物都具有较强的毒副作用，影响了患者的生活质量，故很有必要研发疗效好、毒副作用低的抗癌新药或能够对传统化疗药物起到减毒增效作用的药物。因此，在我国传统中草药中分离筛选无毒或低毒的天然抗肿瘤有效成分具有重要意义。
姜黄素(curcumin, CUR)是中药姜黄(Curcuma longa L.)根茎中提取出的一种多酚类化合物。现代研究发现姜黄素具有抗感染、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用。已有的研究发现，CUR对体外培养的包括结肠癌在内的多种常见肿瘤细胞都有着显著的抑制作用，然而，关于姜黄素对结肠癌细胞生长抑制作用、诱导凋亡作用和迁移抑制作用的分子机制尚未完全揭示，有待于进行全面而深入的研究。
二、研究目的
本课题的研究目的是，在细胞水平和分子水平上全面研究CUR对结肠癌细胞的生长、增殖、迁移的抑制效应和凋亡诱导效应及其分子机理。了解CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖和凋亡的影响以及CUR对HCT-116细胞转移能力的影响；比较CUR与常用化疗药5-FU在抑制结肠癌细胞的生长、转移和诱导该细胞凋亡的作用效果；揭示CUR抑制结肠癌细胞生长、转移和诱导该细胞凋亡的分子机制，为CUR应用于结肠癌的临床治疗提供初步的实验依据。
三、实验方法
体外培养人结肠癌HCT-116细胞株、人结肠癌SW620细胞株至对数生长期，使用不同剂量的CUR和5-FU体外作用细胞后，再分别通过下列实验方法检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和结肠癌SW620细胞生长、凋亡与转移调控的相关实验指标。
1.运用CCK-8(Cell Counting Kit-8 )实验检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖能力的影响，探索CUR对这两种结肠癌细胞的半数抑制浓度(IC50)，并以此结果为依据，拟定后续实验分组所用浓度；
2.运用CCK-8实验检测不同浓度CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞作用不同时间的增殖抑制效应，并统计计算CUR对结肠癌细胞的增殖抑制率；
3.运用平板克隆实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞生长活力的影响，并统计实验结果，计算CUR对HCT-116细胞的生长活力抑制率；
4.运用PI单染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞周期的影响；5.运用AO/EB双染法观察CUR对结肠癌HCT-116细胞凋亡形态的影响，并统计观察结果，计算结肠癌细胞的凋亡率；
6.运用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞凋亡的诱导效应，并计算结肠癌细胞的凋亡率；
7.运用RT-qPCR实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3mRNA表达的影响，并计算其相对表达水平；
8.运用Westernblot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞NF-κB、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3蛋白表达的影响，并计算其相对表达水平；9.运用细胞划痕实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞的迁移能力的影响，并计算CUR对结肠癌细胞的迁移的抑制率；
10.运用Transwell侵袭实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞侵袭能力的影响，并计算CUR对结肠癌细胞侵袭的抑制率；
11.构建人工转移模型，检测CUR对结肠癌HCT-116细胞在小鼠肺中转移的抑制效应，并计算其转移抑制率；
12.运用明胶酶谱实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞MMP-9表达的影响，并计算其相对表达水平；
13.运用Westernblot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞E-cadherin、Claudin-3蛋白表达的影响，并计算其相对表达水平。
四、结果
1.CCK-8实验所得IC50检测结果表明，CUR体外作用结肠癌HCT-116细胞24h的IC50为22μM，CUR体外作用结肠癌SW620细胞24h的IC50为49μM。
2.CCK-8实验结果显示，与对照组(Control)相比，不同浓度CUR和5-FU体外作用于结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞24h、36h和48h后，其生长和增殖能力被CUR显著抑制(*P＜0.05)，且姜黄素对细胞生长与增殖抑制率随着浓度和时间的增加而升高，呈现剂量与时间依赖效应。此外，CUR高剂量组的增殖抑制率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
3.平板克隆形成实验结果显示，不同浓度CUR和5-FU体外作用HCT-116细胞24h后，与Control组相比，能显著抑制该细胞的生长分裂活性(*P＜0.05)，且其抑制率随着浓度的增加而升高；此外，CUR高剂量组的克隆形成抑制率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
4.基于PI单染的流式细胞术检测结果显示，与Control组比较，CUR能使HCT-116细胞显著地阻滞在细胞周期的S期(P＞0.05)。
5.凋亡形态学显微观察结果显示，不同浓度CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，呈现早期凋亡和晚期凋亡形态的细胞比例增多，凋亡率均有显著性差异(*P＜0.05)，且其凋亡率随着浓度的增加而升高；同时，高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
6.AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术实验结果显示，CUR体外作用于HCT-116和SW620细胞24h和48h后，与Control组对比，各实验组中发生凋亡细胞的比例显著增加，凋亡率均有显著性差异(*P＜0.05)，且细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而升高；此外，高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
7.细胞划痕实验的结果显示，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各剂量CUR组能显著抑制划痕愈合，其愈合率均有显著性差异(*P＜0.05)，且其愈合率随着浓度的增加而降低；此外，CUR高剂量组的愈合率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
8.Transwell实验的结果显示，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各剂量组CUR均能显著抑制肿瘤细胞穿越小室，其穿越抑制率均有显著性差异(*P＜0.05)，且穿越抑制率随着浓度的增加而升高；但高剂量CUR组的抑制率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
9.人工转移模型实验的结果提示，CUR作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，能显著抑制HCT-116细胞转移至小鼠肺中(*P＜0.05)。
10.明胶酶谱实验检测结果表明，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各实验组中HCT-116细胞MMP-9的表达水平显著降低(*P＜0.05)，并且呈现出剂量依赖效应。
11.RT-qPCR实验结果表明，CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，显著增强了该细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等基因的mRNA的相对表达水平(*P＜0.05)。
12.Westernblot实验结果显示，不同剂量CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，显著升高了Fas、FADD、caspase-8、caspase-3、E-cadherin等蛋白的相对表达水平，显著抑制了NF-κB、Claudin-3蛋白的相对表达水平(*P＜0.05)。
五、结论
1.姜黄素能显著抑制体外培养的结肠癌HCT-116和SW620细胞生长与增殖能力，呈现出剂量和时间依赖的特点，且姜黄素对于结肠癌细胞增殖的抑制作用能够达到5-FU作用的水平；
2.姜黄素可将结肠癌HCT-116细胞阻滞在细胞增殖周期的S期，从而抑制该细胞的分裂增殖。
3.姜黄素显著诱导结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞发生凋亡，并呈现剂量依赖效应，且其诱导凋亡能力可达到5-FU作用的水平；
4.姜黄素显著抑制结肠癌HCT-116细胞在体内和体外的转移能力，并呈现剂量依赖效应，且CUR的转移抑制能力可达到5-FU的作用水平；
5.姜黄素诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的潜在分子调控机制可能与激活Fas死亡受体通路信号有关；姜黄素抑制结肠癌HCT-116细胞转移的潜在分子机制可能与抑制EMT的发生有关；其共同的上游靶点可能受NF-κB的调控。
结肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居各类肿瘤的前列，已严重影响到人们的生活质量。结肠癌临床治疗常采用的方式有手术切除、放疗、化疗、免疫疗法和分子靶向治疗等。手术切除主要适用于早期局限转移的肿瘤患者，如Ⅰ期结肠癌，Ⅱ、Ⅲ期结肠癌则采用手术与化疗结合治疗，而进展性晚期结肠癌治疗主要以化疗为主。可见在各阶段结肠癌的治疗中，化学药物治疗占有重要地位，已成为结肠癌的主体治疗方式。
氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和伊立替康(Irinotecan)是临床治疗结肠癌常用化疗药，其中5-FU作为结肠癌的基础药物，在过去40多年中一直是重要的化疗主体药物，是目前临床上应用最广的尿嘧啶类抗代谢药物，属于不典型的细胞周期特异性药，除了主要作用于S期细胞外，对处于细胞周期其它时相的细胞亦有作用。该药的疗效显著，抗癌谱较广。然而，5-FU会对患者产生的较强毒副作用以及难以逆转的耐药性。鉴于5-FU等结肠癌化疗药物都具有较强的毒副作用，影响了患者的生活质量，故很有必要研发疗效好、毒副作用低的抗癌新药或能够对传统化疗药物起到减毒增效作用的药物。因此，在我国传统中草药中分离筛选无毒或低毒的天然抗肿瘤有效成分具有重要意义。
姜黄素(curcumin, CUR)是中药姜黄(Curcuma longa L.)根茎中提取出的一种多酚类化合物。现代研究发现姜黄素具有抗感染、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用。已有的研究发现，CUR对体外培养的包括结肠癌在内的多种常见肿瘤细胞都有着显著的抑制作用，然而，关于姜黄素对结肠癌细胞生长抑制作用、诱导凋亡作用和迁移抑制作用的分子机制尚未完全揭示，有待于进行全面而深入的研究。
二、研究目的
本课题的研究目的是，在细胞水平和分子水平上全面研究CUR对结肠癌细胞的生长、增殖、迁移的抑制效应和凋亡诱导效应及其分子机理。了解CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖和凋亡的影响以及CUR对HCT-116细胞转移能力的影响；比较CUR与常用化疗药5-FU在抑制结肠癌细胞的生长、转移和诱导该细胞凋亡的作用效果；揭示CUR抑制结肠癌细胞生长、转移和诱导该细胞凋亡的分子机制，为CUR应用于结肠癌的临床治疗提供初步的实验依据。
三、实验方法
体外培养人结肠癌HCT-116细胞株、人结肠癌SW620细胞株至对数生长期，使用不同剂量的CUR和5-FU体外作用细胞后，再分别通过下列实验方法检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和结肠癌SW620细胞生长、凋亡与转移调控的相关实验指标。
1.运用CCK-8(Cell Counting Kit-8 )实验检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖能力的影响，探索CUR对这两种结肠癌细胞的半数抑制浓度(IC50)，并以此结果为依据，拟定后续实验分组所用浓度；
2.运用CCK-8实验检测不同浓度CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞作用不同时间的增殖抑制效应，并统计计算CUR对结肠癌细胞的增殖抑制率；
3.运用平板克隆实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞生长活力的影响，并统计实验结果，计算CUR对HCT-116细胞的生长活力抑制率；
4.运用PI单染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞周期的影响；5.运用AO/EB双染法观察CUR对结肠癌HCT-116细胞凋亡形态的影响，并统计观察结果，计算结肠癌细胞的凋亡率；
6.运用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞凋亡的诱导效应，并计算结肠癌细胞的凋亡率；
7.运用RT-qPCR实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3mRNA表达的影响，并计算其相对表达水平；
8.运用Westernblot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞NF-κB、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3蛋白表达的影响，并计算其相对表达水平；9.运用细胞划痕实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞的迁移能力的影响，并计算CUR对结肠癌细胞的迁移的抑制率；
10.运用Transwell侵袭实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞侵袭能力的影响，并计算CUR对结肠癌细胞侵袭的抑制率；
11.构建人工转移模型，检测CUR对结肠癌HCT-116细胞在小鼠肺中转移的抑制效应，并计算其转移抑制率；
12.运用明胶酶谱实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞MMP-9表达的影响，并计算其相对表达水平；
13.运用Westernblot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞E-cadherin、Claudin-3蛋白表达的影响，并计算其相对表达水平。
四、结果
1.CCK-8实验所得IC50检测结果表明，CUR体外作用结肠癌HCT-116细胞24h的IC50为22μM，CUR体外作用结肠癌SW620细胞24h的IC50为49μM。
2.CCK-8实验结果显示，与对照组(Control)相比，不同浓度CUR和5-FU体外作用于结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞24h、36h和48h后，其生长和增殖能力被CUR显著抑制(*P＜0.05)，且姜黄素对细胞生长与增殖抑制率随着浓度和时间的增加而升高，呈现剂量与时间依赖效应。此外，CUR高剂量组的增殖抑制率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
3.平板克隆形成实验结果显示，不同浓度CUR和5-FU体外作用HCT-116细胞24h后，与Control组相比，能显著抑制该细胞的生长分裂活性(*P＜0.05)，且其抑制率随着浓度的增加而升高；此外，CUR高剂量组的克隆形成抑制率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
4.基于PI单染的流式细胞术检测结果显示，与Control组比较，CUR能使HCT-116细胞显著地阻滞在细胞周期的S期(P＞0.05)。
5.凋亡形态学显微观察结果显示，不同浓度CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，呈现早期凋亡和晚期凋亡形态的细胞比例增多，凋亡率均有显著性差异(*P＜0.05)，且其凋亡率随着浓度的增加而升高；同时，高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
6.AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术实验结果显示，CUR体外作用于HCT-116和SW620细胞24h和48h后，与Control组对比，各实验组中发生凋亡细胞的比例显著增加，凋亡率均有显著性差异(*P＜0.05)，且细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而升高；此外，高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
7.细胞划痕实验的结果显示，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各剂量CUR组能显著抑制划痕愈合，其愈合率均有显著性差异(*P＜0.05)，且其愈合率随着浓度的增加而降低；此外，CUR高剂量组的愈合率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
8.Transwell实验的结果显示，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各剂量组CUR均能显著抑制肿瘤细胞穿越小室，其穿越抑制率均有显著性差异(*P＜0.05)，且穿越抑制率随着浓度的增加而升高；但高剂量CUR组的抑制率与5-FU组相比无显著性差异(P＞0.05)。
9.人工转移模型实验的结果提示，CUR作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，能显著抑制HCT-116细胞转移至小鼠肺中(*P＜0.05)。
10.明胶酶谱实验检测结果表明，CUR体外作用于HCT-116细胞后，与Control组相比，各实验组中HCT-116细胞MMP-9的表达水平显著降低(*P＜0.05)，并且呈现出剂量依赖效应。
11.RT-qPCR实验结果表明，CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，显著增强了该细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等基因的mRNA的相对表达水平(*P＜0.05)。
12.Westernblot实验结果显示，不同剂量CUR体外作用于HCT-116细胞24h后，与Control组相比，显著升高了Fas、FADD、caspase-8、caspase-3、E-cadherin等蛋白的相对表达水平，显著抑制了NF-κB、Claudin-3蛋白的相对表达水平(*P＜0.05)。
五、结论
1.姜黄素能显著抑制体外培养的结肠癌HCT-116和SW620细胞生长与增殖能力，呈现出剂量和时间依赖的特点，且姜黄素对于结肠癌细胞增殖的抑制作用能够达到5-FU作用的水平；
2.姜黄素可将结肠癌HCT-116细胞阻滞在细胞增殖周期的S期，从而抑制该细胞的分裂增殖。
3.姜黄素显著诱导结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞发生凋亡，并呈现剂量依赖效应，且其诱导凋亡能力可达到5-FU作用的水平；
4.姜黄素显著抑制结肠癌HCT-116细胞在体内和体外的转移能力，并呈现剂量依赖效应，且CUR的转移抑制能力可达到5-FU的作用水平；
5.姜黄素诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的潜在分子调控机制可能与激活Fas死亡受体通路信号有关；姜黄素抑制结肠癌HCT-116细胞转移的潜在分子机制可能与抑制EMT的发生有关；其共同的上游靶点可能受NF-κB的调控。