研究背景：在心血管疾病领域中,急性心肌梗死（Acute myocardial infarction, AMI）的发病率日益增加,也成为目前所公认导致患者死亡的最主要病因。虽然近20年来,AMI的再灌注治疗经历了从药物溶栓到经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention, PCI）和冠状动脉旁路移植术（Coronary Artery Bypass Grafting, CABG）的飞跃发展,不仅可以有效恢复缺血心肌的血运重建,也积极改善了患者的预后和生活质量,但与此同时却带来了一个不容忽视的潜在威胁-即缺血心肌在恢复血供后发生的缺血-再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury, IRI）。IRI的定义在1960年由Jennings等首次提出：缺血心肌在重获血流灌注或氧供后,反而加重了原有缺血组织的损伤。临床上主要表现为再灌注性心律失常；心肌顿抑和微血管顿抑以及心肌结构的变化,最终造成心肌不可逆性损伤坏死。近年来,国内外大量的基础和临床研究发现再灌注损伤的机制复杂,虽尚未彻底阐明,但目前所公认的机制集中在自由基增多；白细胞积聚释放大量具有趋化作用的炎症介质以及钙超载^[1]。其中,氧自由基（oxygen free radical,OFR）的大量生成是造成I/R损伤的重要环节,OFR在MIRI情况下使心肌细胞膜流动性降低,细胞基质降解,胞内蛋白质损伤,线粒体功能抑制,此外,还可直接作用于胞核内DNA引起基因突变和染色体畸变断裂,最终将导致心肌细胞凋亡,细胞坏死等组织结构的变化[2，3]。因此,更加精确深入的探索OFR在IRI各个关键时段的作用,寻求积极有效的方法对抗氧化应激的靶点,在最大程度上减少心肌血运复件后带来的种种问题,将成为临床AMI治疗的关键所在。1997,Kuro等[4]在研究盐敏感性高血压时发现了一个与衰老密切相关的基因并将其命名为Klotho（Kl）基因。该基因主要表达于肾脏和大脑,在人与大鼠、小鼠间有高度同源性。在人和小鼠中均定位于第13号染色体（13q12）。Kl基因在生物体内主要可通过选择性拼接产生两种蛋白产物：一种为膜型Kl蛋白,主要在肾脏、胎盘、小肠和前列腺中表达;另一种为分泌型K1蛋白,在人的大脑、海马、胎盘、肾脏、前列腺和小肠等组织中和血清中均可检测到其存在。目前的研究发现在血循环中的分泌型K1蛋白可发挥类激素样作用来参与对机体功能的调节。它与细胞表面受体结合,通过抑制胞内胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulin/IGF）信号转导通路,对生物体内多种靶器官发挥抗衰老；抗氧化和凋亡：脏器保护以及参与钙磷调节、糖尿病、高血压及多条信号通路等功能^[5-8]。在心脏中,Klotho基因缺失将导致严重的心律失常和死亡。由于Klotho基因表达缺陷的小鼠呈现出各种和人类衰老相似的表型,而心血管疾病如冠状动脉粥样硬化、高血压等的发生发展和年龄因素密切相关,因此近年K1基因在心血管病中的作用逐步受到重视,过去的研究中对于Klotho转基因技术多集中肾脏的抗缺血再灌注损伤作用方面,取得了令人满意的结果,但是对于Klotho基因在心肌缺血再灌注损伤方面却研究甚少。这也是我们构建携带Klotho基因重组腺病毒对大鼠心肌缺血再灌注损伤作用并探讨其可能机制的重要出发点。研究方法：实验一：选取新生1-3天SD大鼠的乳鼠采用改良方法分离和培养原代心肌细胞,在缺氧复氧箱中模拟在体心肌缺血／再灌注（I/R）模型。实验分为三组：正常control组、H/R组、H/R+klotho组。复氧结束后心肌细胞再培养24小时,显微镜下观察心肌细胞的搏动和形态学变化,CCK-8法检测心肌细胞存活率；酶联免疫吸附法（ELISA试剂盒）检测培养细胞损伤时释放到上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）含量；采用流式细胞术测定心肌细胞的凋亡；DCFH-DA探针试剂盒在流式细胞仪下记录活性氧物质（ROS）的数值变化；免疫荧光技术观察不同处理条件核转录因子（Foxol）胞内核转移的影响；Western blot方法测定心肌细胞FOXO1/p-FOXO1, Akt/p-Akt, SOD2的蛋白表达。实验二：然后再通过酶切GB135质粒,得到载体条带后与目的基因连接转化,经过筛选得到重组GB135-klotho质粒。核酸分析进行全序列测定证实了质粒构建正确。然后制备感受态细胞,进行转化后大量制备质粒DNA；用质粒DNA转染293细胞,计算转染细胞病毒滴度后得到目的重组腺病毒Ad-Klotho。最后进行病毒扩增纯化后-70℃保存备用。实验三：选取健康雄性SD大鼠70只,200-250g, SPF级,由武汉大学实验动物中心提供,随机分为四组：假手术对照组（SH）、I/R+生理盐水组（NS）、I/R+空病毒载体组（Ad）和I/R+Ad-klotho转染组,SH组10只,其余各组20只。重组腺病毒间接颈外静脉转染大鼠,3天后大鼠开胸手术建立心肌缺血/再灌注（I/R）模型（缺血30min,再灌注24h）。24h后,各组取4只大鼠左心室和肝、肾组织制作冰冻切片,荧光显微镜下检测转染率；HE染色观察心肌结构变化；心肌相对梗死面积采用伊文式兰/TTC双染法进行测定；TUNEL染色在光学显微镜下计算梗死区组织的心肌细胞凋亡数目；酶联免疫吸附测定（ELISA）血清中心肌酶LDH、 CK-MB的含量,以及TNF-a、IL-1β的浓度;real-time RT-PCR方法检测心肌组织中Klotho mRNA的表达;Western blot方法测定心肌组织中Klotho蛋白、NF-kB及Akt/PAkt的表达。研究结果：实验一：体外原代培养心肌细胞的实验结果：H/R组心肌细胞的存活率与正常control组明显下降；细胞培养基中的LDH活性增高；心肌细胞凋亡率显著上升；而与H/R组相比,H/R+klotho处理组的心肌细胞存活率增加、LDH活性明显降低、心肌细胞凋亡显著减少。与正常control组相比,H/R组心肌细胞的ROS生成明显增多,而在H/R+klotho处理组中,随着Klotho浓度的增加,细胞内的ROS显著减少；为进一步探索Klotho蛋白的作用机制,我们用免疫荧光和免疫印迹法证实了Klotho蛋白可以抑制Foxol的磷酸化并阻止其核外转移,同时,证实了这一作用是通过抑制Akt磷酸化而实现。此外,Western blot结果提示在H/R+klotho组中SOD2的表达增多。实验二：腺病毒载体的构建：在本研究中成功构建了重组腺病毒载体Ad-klotho,经HEK293细胞大量扩增,获得病毒滴度约3×1011pfu/ml;大鼠转染重组腺病毒Ad-klotho后48h,在心肌、肝脏、肾脏中可检测到klothomRNA及蛋白的表达,证实了该基因大鼠体内过表达比较稳定。实验三：在体实验结果：I/R+Ad和I/R+Ad-klotho转染组心肌中荧光蛋白的表达无显著差异（P>0.05）,其转染率分别为心肌：Ad53.1±2.3%和56.7±4.0%；心肌缺血再灌注损伤造模成功后,SH、I/R+NS和I/R+Ad组心肌组织klotho-mRNA表达无明显差异（P>0.05）,均显著低于I/R+Ad-klotho组（P<0.01）；与SH组相比,I/R+NS、I/R+Ad和I/R+Ad-klotho组中的血清LDH和CK-MB水平均明显升高（P<0.01）,梗死心肌重量（ISW）、心肌相对梗死面积（ISW/AARW）及TUNEL染色的凋亡指数明显增加；血清中的炎症因子TNF-a、IL-1β浓度上升；这些数据均提示心肌组织因缺血再灌注而造成损伤。与I/R+NS和Ad组比较：klotho组中血清LDH和CK-MB水平显著减少（P<0.01）；HE染色镜下见心肌病理改变减轻,梗死心肌重量（ISW）、心肌相对梗死面积（ISW/AARW）及TUNEL染色的凋亡指数减少（P<0.01）;NF-kB的表达显著下降；Klotho蛋白的表达显著增高；P-Akt表达显著减少。研究结论：1.本实验中成功在体外培养了乳鼠心肌细胞并构建缺氧复氧模型,证实了人重组Kl蛋白对乳鼠心肌细胞在氧化应激状态下有显著保护作用,这一作用机制可能与其抑制Akt磷酸化,阻止Foxol核转移有关。2.本实验成功构建了携带klotho基因的Ad-klotho系统,经HEK293细胞扩增,后所获得的病毒滴度和纯度均满足在体实验的需要,为研究klotho基因过表达对心肌缺血再灌注损伤的影响提供了可靠载体。3.本实验首先通过腺病毒介导的klotho基因颈外静脉转染,在大鼠体内高表达klotho,然后建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,证实了体内klotho的高表达能够减轻再灌注损伤后心肌结构的破坏,缩小心肌梗死面积、抑制心肌细胞凋亡,减轻炎症反应的发生,从而产生心肌保护作用。4.本实验首次对klotho基因在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制进行了深入探讨,klotho基因转染和其分泌型kl蛋白有望成为治疗MIRI的一种新方法。