第一部分HPLC-UV法测定人血浆中瑞芬太尼浓度目的:瑞芬太尼是一种新型的超短效阿片类受体激动剂,其结构独特,易被血浆和组织中的非特异性酯酶代谢,起效快,迅速达到血-脑平衡,作用消失也快,从而使麻醉的可控性明显提高,日益受到人们的关注。本实验通过建立高效液相色谱-紫外检测法测定人血浆中瑞芬太尼的浓度,旨在为临床用药提供实验数据,进而为临床合理用药提供理论依据。方法:本文采用RP-HPLC外标法测定血浆样品中瑞芬太尼的浓度。先用1-氯丁烷萃取,再将药物反提至0.01 mol·L-1盐酸中,以spherisorb-CN(4.6 mm×250 mm, 5μm, Waters)色谱分析柱为固定相;流动相为0.02 mol·L-1的NaH2PO4水溶液-乙腈(70:30),内含三乙胺0.01%,流速1.5 mL·min-1 ,柱温为室温,紫外检测波长为210 nm,进样量为200μL。通过对日内、日间精密度、提取回收率、线性范围和检测限的确定,进一步对方法学进行评价。选择择期行胸科手术病人6例,ASAI~II级,年龄45~65岁,体重指数不超过30%。麻醉诱导用静脉注射瑞芬太尼4μg·kg-1复合异丙酚2.5 mg·kg-1,待病人意识消失后静脉注射罗库溴铵,行气管插管,持续吸入七氟醚,间断注射维库溴铵0.03 mg·kg-1维持肌松。分别在瑞芬太尼注射前和注射后1、2、3、5 min从肘正中静脉采血3 mL,置肝素试管中,迅速加入10 mg·mL-1枸橼酸60μL,充分摇匀后离心取上清液立即放入低温冰箱保存,用高效液相色谱仪测定瑞芬太尼血药浓度。结果:在本实验建立的分析条件下,柱效良好,血浆中药物和基线分离良好且选择性高,在血药浓度5~300 ng·mL-1的线性范围内,以瑞芬太尼血浆浓度C (ng·mL-1)对其色谱峰面积(A)作线性回归,得瑞芬太尼的标准曲线方程为: Y = -1585 +530.54X, r = 0.9996 (n = 7)。血浆中瑞芬太尼的检测限为2.5 ng·mL-1。血浆高(200 ng·mL-1)、中(50 ng·mL-1)、低(10ng·mL-1)浓度的日内精密度分别为3.06%,5.13%和7.06%;日间精密度分别为5.33%,5.69%和8.91%。提取回收率分别为(88.99±2.20)%,(83.72±2.31)%和(83.47±1.76)%。冰中放置稳定性和冻存稳定性的RSD分别为5.52%和5.87%。冻融实验前后浓度与标示量的比值均小于15%。结论:本实验建立了测定体内瑞芬太尼浓度的HPLC分析方法,该方法操作简便,分离度好,其专属性、准确度、精密度、线性范围及稳定性均适合实际样品的检测。第二部分联合瑞芬太尼对异丙酚药代动力学的影响目的:在复合麻醉时,异丙酚麻醉药和阿片类药物的相互作用关系复杂,确定两者的相互作用关系,研究二者的药代动力学相互作用具有重要的临床意义。本实验通过用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对异丙酚体内血药浓度进行检测,研究联用瑞芬太尼前后对异丙酚在体内药代动力学的影响,为临床合理应用药物提供实验和理论依据。方法:色谱条件:采用反相高效液相色谱-荧光检测技术,美国Waters高效液相色谱系统,分离色谱柱为Waters Symmetry C18 (3.9 mm×150 mm, 5.0μm),保护柱为Symmetry C18,以甲醇和水(75:25)混合,加入冰醋酸调pH = 4.0为流动相,荧光激发波长270 nm,发射波长295 nm。流速:1.0 mL·min-1,柱温为室温,取上清液20μL进行HPLC分析。血浆样品处理方法:取血浆250μL,精密加入麝香草酚内标溶液(10μg·mL-1)10μL和甲醇750μL,旋涡振荡30 s,混匀,离心10 min (10000 r·min-1),吸取上清液过滤(0.45μm微孔滤膜),取20μL进样分析测定,重复两次取其平均值。标准曲线方程的建立:于空白血浆中分别加入异丙酚标准储备液,配制成浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg·mL-1的系列血浆标准液,按上述“样品处理”操作,以样品吸收峰面积(As)与内标吸收峰面积(Ai)比值(Y)对样品浓度(C)作直线回归。方法学考察:考察方法的精密度、提取回收率和稳定性试验。给药方法及血样采集:选择择期行胸科手术病人21例,ASAI~II级,年龄40~65岁,体重指数不超过30%,拟行全麻下手术,分为3组(分别用I~III组表示),每组7例(n=7)。第I组:麻醉前30 min给予咪唑安定0.05 mg·kg-1和阿托品0.5 mg,连续监测桡动脉血压、心电图、脉搏血氧饱和度(SpO2)、呼气末二氧化碳分压(PETCO2)、脑电双频指数(BIS)和心率变异性各成分。麻醉诱导用静脉注射异丙酚2.5 mg·kg-1,待病人意识消失后静脉注射罗库溴铵,行气管插管,插管成功后,连接麻醉呼吸机维持通气,维持呼气末PETCO230~40 mmHg。持续吸入七氟醚,间断注射维库溴铵0.03 mg·kg-1维持肌松;第II组:麻醉诱导用静脉注射异丙酚2.5 mg·kg-1和瑞芬太尼4μg·kg-1,其余同第I组;第III组:麻醉诱导用静脉注射异丙酚2.5 mg·kg-1和靶控输注瑞芬太尼6 ng·ml-1,其余同第I组。经前臂静脉注射异丙酚,分别于注射前和注射后2、4、6、10、15、30、45、60、90、120、180 min从右侧肘正中静脉采血2 mL,肝素抗凝,离心后取上层血浆于低温冰箱保存。数据处理:血浆样品结果应用DAS软件进行处理,计算房室模型和药代动力学参数,SPSS软件包进行统计分析。结果:血浆中异丙酚测定方法学认证:异丙酚的色谱行为及专一性:本实验建立了血浆中异丙酚的RP-HPLC检测方法,异丙酚和麝香草酚均有较大的吸收峰,分离效率好、专属性强。异丙酚的保留时间约为6 min,内标麝香草酚的保留时间约为4 min,且血浆中杂质或内源性物质均不干扰异丙酚的测定。回归方程和检测限:标准曲线方程为: Y = 1.5826X -0.1264 (r=0.9996,n=9)。说明血浆中异丙酚浓度在0.0625~16μg·mL-1范围内线性关系良好,本实验条件测得异丙酚的检测限为0.03125μg·mL-1。血浆样品回收率与精密度考察:结果表明,在高、中、低(分别为8,1,0.125μg·mL-1)三个浓度下提取回收率分别为84.32±1.17,83.21±1.24, 79.85±1.50,日内及日间RSD均小于5.90%。单用异丙酚与联用瑞芬太尼后的异丙酚药动学研究:结果表明,三组病人单次静脉注射异丙酚2.5 mg·kg-1后血浆浓度迅速下降。患者性别,年龄,收缩压,舒张压,心率,差异无统计学意义(P>0.05)。异丙酚药代动力学模型符合二室开放模型。药代动力学参数:分布半衰期(T1/2a),消除半衰期(T1/2β),浓度-时间曲线下面积(AUC),清除率(CL)及中央室容积(Vc),各组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论:RP-HPLC法测定血浆异丙酚浓度,方法简便,准确,灵敏度高,重现性好,适用于临床异丙酚血药浓度监测及药代动力学研究。静脉注射和靶控输注瑞芬太尼不影响异丙酚药代动力学特征。